蛋白质与酶工程.ppt

第六章酶(蛋白质)分子的化学修饰（蛋白质水平的分子改造）酶分子的化学修饰就是在体外通过人工的方法将酶分子与一些化学基团或化学物质(修饰试剂)进行共价连接从而改变酶的结构和性质。基础研究：①探测酶活性必需氨基酸的性质和数目；②探测酶蛋白的结构变化与功能的关系；③测定酶蛋白部分区域的构象状态；④探索酶的作用机理和催化反应历程；⑤研究酶的固定化技术。应用研究：①提高酶的稳定性；②改善酶的催化特性；③提高蛋白药物在体内不稳性、消除免疫原性及靶向性（病灶细胞）。第32页,共49页，星期六，2024年，5月第一节酶化学修饰的基本条件必须对被修饰酶的性质、修饰原理、修饰剂和反应条件等方面有足够的了解一、被修饰酶的性质1、基本性质热、酸碱稳定性，最适温度、pH，pI，抑制剂，蛋白酶水解部位等。2、酶活性中心氨基酸残基数目、性质及其地位、有无辅助因子及种类。第33页,共49页，星期六，2024年，5月3、被修饰氨基酸侧链基团的性质及反应性常被修饰的侧链基团：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等①巯基的修饰试剂烷基化试剂：碘乙酸、碘乙酸胺、巯基乙醇、谷胱甘肽汞试剂：HgCl2、对氯汞苯甲酸、2-氯汞硝基苯酚Ellman试剂：5，5’-二硫-二-2-硝基苯甲酸第34页,共49页，星期六，2024年，5月②氨基的修饰试剂乙酸酐、2，4，6-三硝基苯磺酸、2，4-二硝基氟苯、苯异硫氰酸酯、碘乙酸③羧基的修饰试剂甲醇、硼氟化三甲锌盐（-COOCH3）④咪唑基的修饰试剂碘乙酸、碘乙酸胺⑤吲哚基的修饰试剂光敏试剂（打开吲哚环）、4-硝基苯硫氯第35页,共49页，星期六，2024年，5月⑥甲硫氨酸侧链基团的修饰试剂碘代乙酰胺、H2O2或光敏试剂(E-S-CH3的硫氧化)⑦二硫键的修饰试剂二硫苏糖醇、2-巯基乙醇⑧酚基的修饰试剂N-乙酰咪唑、二异丙基氟磷酸⑨胍基的修饰试剂丁二酮、苯乙二醛（结合在胍基的两个氨基上）第36页,共49页，星期六，2024年，5月二、修饰反应的条件酶稳定、修饰率高、活力回收高(实验探索确定)1、pH与离子强度①决定了侧链基团的解离状态和反应性能②有些修饰试剂在不同pH条件下与同一基团可形成不同产物。2、修饰反应的温度与时间严格控制温度和时间可以减少以至消除一些非专一性的修饰反应。3、反应体系中酶与修饰剂的比例第37页,共49页，星期六，2024年，5月第二节酶化学修饰的方法酶表面修饰、酶内部修饰金属离子置换修饰,大分子修饰(共价/非共价)侧链基团修饰（小分子修饰）肽链有限水解修饰固定化修饰第38页,共49页，星期六，2024年，5月1、金属离子置换修饰把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+)若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。第39页,共49页，星期六，2024年，5月金属离子置换修饰的过程a.酶的分离纯化：首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。b.除去原有的金属离子：在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。此时，酶往往成为无活性状态。c.加入置换离子：于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。金属离子置换修饰只适用