岩藻糖基化对抗体功效影响.pdfVIP

抗体的岩藻糖基化的关键作用

产品质量属性对于治疗性抗体的功能性和可制造性是至关重要的。它们可能受到许多生产工

艺参数的显著影响，例如细胞培养基。生长培养基和补料培养基的成分可以影响抗体糖基化，包括

氨，谷氨酰胺，葡萄糖和金属离子的浓度。因此，在培养基开发和优化过程中培养基对糖基

化的影响至关重要。对于作用机制包括抗体依赖的细胞介导的细胞毒性（ADCC）作用的治疗

性抗体，测量Fc结构域中Asn297处的N-聚糖岩藻糖基化是特别重要的，众所周知，这强烈

影响ADCC活性。

在ADCC中，抗体首先结合细胞表面靶抗原，然后募集免疫效应细胞来裂解靶细胞。已有

研究显示降低Asn297的岩藻糖基化可增加抗体对天然细胞上CD16（Fcγ受体IIIa）的

亲和力，并最终增加ADCC效力。因此，研究人员对降低岩藻糖基化以提高多种糖工程治疗

性抗体临床疗效显示出极大的。

我们通过使用糖转移酶抑制剂产生具有不同水平的岩藻糖基化的相关治疗性抗体（曲妥珠单

抗）来研究它们对ADCC活性的影响。使用报告ADCC测定方法，我们抗体岩藻糖

基化的变化及其对抗体ADCC活性的影响。正如我们所预期的，降低岩藻糖基化水平可提高

ADCC效应（即更低的EC50）。然而，其他研究者使用人源化CD20抗体和基于细胞的ADCC

细胞毒性测定法观察到岩藻糖基化的差异也显著改变了最大倍数诱导（al-fold

induction）。在这里，我们了ADCC最大倍数诱导的这种增加是通过Fc结构域与CD16

的结合特异性介导的。

材料和方法

流加批次培养生产抗体：为了生产抗人HER2抗体曲妥珠单抗，我们使用Selexis专有CHO-M

细胞系（来自仓鼠细胞系CHO-K1细胞）。使用IrvineScientific的BalanCDCHOGrowth

A培养基，在125mL摇瓶（30mL工作体积）中的流加批次培养时间14天。

为了抑制岩藻糖基化，在接种前向生长培养基中加入100μM的2F-过乙酰基-岩藻糖（货号

＃344827，EMDMillipore）。初始培养条件：37℃，5％CO2，120rpm，在第7天温度调为

（32℃）以维持细胞高活率。每个培养总共添加20％初始工作体积的BalanCDCHOfeed4（具

体为：从第5-9天开始，连续5次，每次4％），将葡萄糖维持在6-8g/L直至培养结束。Beckman

Coulter的Vi-CellXR细胞活率分析仪细胞密度和活率。NovaBiomedical的BioProfileFLEX

系统葡萄糖和乳酸代谢水平。使用带有蛋白A传感器的FortéBioQKeOctet系统测定抗

体滴度。

抗体纯化：收获细胞培养液，离心然后0.2-μm过滤得到上清液，使用GEHealthcarePredictor

MabSelectSuReLX96孔过滤板（＃28-9258-25）蛋白A亲和层析纯化抗体。首先使用pH7

的0.02M磷酸钠缓冲液平衡介质。然后上样澄清的上清液以捕获抗体，用含有0.15MNaCl

的0.02M磷酸钠（pH7）洗涤平板。使用pH3的0.1M甘氨酸-HCl缓冲液洗脱抗体。立即用

pH9的1MTris-HCl缓冲液中和洗脱级分，并用Millipore10-kDaMWCO聚醚砜（PES）膜96

孔过滤板（＃MAU0101）换液至磷酸盐缓冲盐水（PBS）中。

十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS）：使用SDS分析纯化的抗体样品分

子量及其纯度。通过LifeTechnologies的NuPAGEBis-Tris凝胶（4-12％）在非