第三章 细胞工程课件.pptVIP

第三章细胞工程动物组织细胞间隙中含有一定量的弹性纤维等蛋白质，将细胞网络起来形成具有一定弹性和韧性的组织和器官。用胰蛋白酶分散细胞。动物细胞培养适宜的pH为7.2—7.4，此环境下胃蛋白酶（2.0）没有活性，而胰蛋白酶（7.2-8.4）的活性较高。胰蛋白酶第三章细胞工程当继续传代培养时，少部分细胞会克服细胞寿命的极限，获得不死性，这些细胞已经发生了突变，正在朝着同等于癌细胞的方向发展。第三章细胞工程左图显示了创面愈合过程中一个十分有趣的现象。当周边的上皮向创面中央爬行时,一旦上皮细胞互相接触,就停止分化和增殖。该现象就叫“接触抑制”。因此,创面上不会出现多余的皮赘。这是一种十分巧妙和“神秘”的调控现象。细胞的接触抑制第三章细胞工程细胞在贴壁生长过程中，随着细胞分裂，数量不断增加，最后形成一个单层，此时细胞间相互接触，细胞分裂和生长停止，数量不再增加。细胞的接触抑制第三章细胞工程CO2细胞培养箱万级洁净细胞培养室细胞培养瓶细胞培养瓶细胞培养第三章细胞工程4.细胞融合技术细胞融合：又称细胞杂交，是指将不同来源的原生质体（除去细胞壁的细胞）相融合，并使之分化、再生、形成新物种或新品种的技术。或简单定义为将两个或多个细胞融合在一个细胞的过程。细胞融合技术是20世纪60年代发展起来的一项细胞工程技术。细胞融合这种生物现象最初是在动物细胞中发现的。现已证明其可以在种间、属间、科间甚至动物与植物间发生，其范围包括动物、植物和微生物。第三章细胞工程细胞融合技术不但在基础研究（如核质相互关系、基因的作用和定位等）方面有重要作用，而且在动植物的改良、微生物育种、疾病诊治等方面都有良好的发展前景，已经成为细胞工程中的核心技术。3.1细胞融合的方法及其作用机理3.1.1生物学法主要采用病毒促进细胞融合。许多病毒，如仙台病毒、疱疹病毒、天花病毒、副流感型病毒、一些致癌病毒均能诱导细胞融合，其中仙台病毒（HVJ)是最早应用于动物细胞融合的融合剂。第三章细胞工程采用灭活病毒促进细胞融合第三章细胞工程仙台病毒，也称日本血凝病毒，属粘液病毒副流感类群，多型颗粒状，RNA病毒，易在小鼠中蔓延。其毒力低，对人危害小，而且易被紫外线等灭活，是生物学方法中最常用的细胞融合剂。病毒可以用作融合剂机理：许多病毒都具有凝集细胞并使凝集细胞发生融合的能力。许多病毒（如仙台病毒）还具有促进凝集细胞发生融合的能力（因为各种能被其作用的细胞均具有相应受体位点的原因）。现已知道病毒促进融合的有效部位在细胞膜上。第三章细胞工程4.1.2化学融合剂法化学融合剂主要包括：PEG、二甲亚砜、甘油醋酸酯等，在Ca2+存在下皆可促进细胞融合。其中，PEG的应用更为广泛。PEG，聚乙二醇，是一种多聚化合物，表面活性剂，其活性稳定，使用方便。同时，促进细胞融合的能力较强。PEG与水分子以氢键结合，使自由水消失，导致高度脱水的原生质体凝集融合，融合时必须有Ca2+参与。第三章细胞工程4.1.3电处理融合法电融合法是20世纪80年代出现的细胞融合技术。当细胞处于电场中，细胞壁两面产生电势，其数值与外加电场的强度以及细胞的半径成正比。由于细胞膜两面相对电荷正负相吸，使细胞膜变薄，随着外加电场强度升高，膜电场增强，当膜电势增强到临界电势时，细胞膜处于临界膜厚度，导致发生局部不稳定和降解，从而形成微孔，进而质膜开始连接，直到闭合，完成融合。优点：如融合率高；重复性强；对原生质体伤害小；可在显微镜下观察或录像融合过程；免去PEG诱导后的洗涤过程；诱导过程可控性强等。第三章细胞工程4.2细胞融合技术以微生物细胞为例，讲述细胞融合的方法和过程。第三章细胞工程4.2.1微生物原生质体的制备要制备微生物的原生质体，必须有效的除去细胞壁。细菌：细胞壁的主要成分是肽聚糖。一般G+菌易被溶菌酶消化除壁；Gˉ细胞壁成分及结构较复杂，必须采用溶菌酶和EDTA一起处理。一般溶菌酶用量为100～1000U/ml。各类微生物细胞壁结构和组成不同，需采用不同方法脱壁。第三章细胞工程2.3植物细胞培养2.3.1植物细胞培养基的组成及种类植物细胞培养｛（广义）：在无菌条件下，将离体的单个游离细胞在人工控制的环境中培养，以获得再生的完整植