RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影响的实验研究_2.doc

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RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影响的实验研究

RNA干扰Nucleostemin基因对人食管癌Eca109细胞株增殖影响的实验研究作者：

郑学芝，刘桂莲，李丽，孙卫，念红，胡静,蔡子微【摘要】目的筛选NS基因特异性siRNA阳性细胞克隆，研究NS基因特异性RNA干扰对Eca109细胞株体外增殖能力的影响。

方法用脂质体法将NS特异性siRNA表达载体转染Eca109细胞，Zeocin抗生素压力筛选后用PCR方法鉴定阳性克隆；MTT法检测各组细胞的生长增殖情况，RTPCR方法检测NS基因表达量的变化情况。

结果与对照组比较，silencer组肿瘤细胞趋于分化，细胞增殖抑制率超过80%(P0.01)，差异具有显著性；NS基因表达量下降。

结论NS基因特异性RNA干扰抑制人食管癌Eca109细胞株体外增殖，使NS基因表达量下降。

【关键词】Nucleostemin（NS）;RNA干扰；食管癌；基因表达；细胞增殖Abstract：

ObjectiveToscreenNSgenespecificpositivecellclones,andinvestigatetheeffectofhumanesophaguscancerEca109cellsproliferationinvitrobyNSgenespecificRNAinterference.MethodsTheNSsiRNAexpressionvectorwastransfectedintohumanesophaguscancerEca109cellsusingLIPOFECTAMINETMXXXX年新发现的一种蛋白质核因子［1］，该基因在干细胞及人类的数种肿瘤细胞中表达丰度很高，但在分化的成体组织中，该基因却不表达。

二位学者提出干细胞与癌细胞均由相同的蛋白质－NS来决定其细胞自我复制的能力，NS可能是干细胞和肿瘤细胞通过G2/S检验点的特异性调控因子。

本文将以人食管癌Eca109细胞株为实验材料探讨NS基因特异性RNA干扰对食管癌Eca109细胞株体外增殖能力的影响。

1材料和方法1.1材料人食管癌Eca109细胞购于上海细胞所；1640培养基、胎牛血清、胰蛋白酶为Gibco公司；PCDNA4/CNSsilencer质粒[2]；MTT、DMSO、Zeocin、LipofectamineTM2000Reagent：

Invitrogen公司;RNA、DNA试剂盒;RTPCR试剂盒：

TaKaRa公司;引物合成：

上海申能博彩生物科技有限公司。

1.2方法1.2.1细胞培养及NS基因转染人食管癌Eca109细胞培养于含10%FBS的RPMI1640培养基中，置于37℃、5%CO2潮湿空气的CO2培养箱内培养。

脂质体法将PCDNA4/CNSsilencer质粒及空载体PCDNA4/Cvector质粒转染Eca109细胞，分别命名为silencer组、vector组，未转染的Eca109细胞记为normal组。

转染细胞进行Zeocin抗生素筛选；阳性细胞克隆继续在含Zeocin抗生素的培养基中进行扩大培养。

1.2.2阳性细胞克隆的鉴定提取克隆细胞基因组DNA，以Zeocin基因为目的基因，通过PCR方法进行细胞克隆外源基因整合阳性鉴定，同时以normal组肿瘤细胞作对照。

其引物序列为：

上游引物5atggccaagttgaccagtgc；下游引物为5tcagtcctgctcctcggcca。

PCR反应条件为：

94℃预变性5min，然后94℃变性30sec，60℃退火3