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By医药观察媛
分子生物学常用实验技术操作方法
目录
一、感受态细菌制备2
二、质粒转化.2
三、质粒提取.2
四、质粒转染.3
五、siRNA转染3
六、免疫印迹分析WB3
七、BCA蛋白定量4
八、细胞总mRNA提取4
九、Real-timequantitativePCR检测mRNA的表达5
十、免疫沉淀.5
十一、MTT法检测细胞增殖6
十二、细胞克隆实验6
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By医药观察媛
一、感受态细菌制备
取冻存Top10菌液冰上解冻,无菌吸取50µl至4mlLB培养
基中,放于摇床200rpm,37℃培养过夜。次日无菌吸取约40µl菌
液重新接种到4mlLB培养基中,继续孵育1~2小时。将菌液分装
转移至无菌2ml离心管中,冰上放置10~15分钟,4℃,3,000×
g离心5分钟收集菌体。弃去上清,用1ml预冷的100mM
CaCl2轻轻重悬细菌,冰上放置30分钟,4℃,3,000×g离心5
分钟收集细菌。弃去上清,加入100µl预冷的100mMCaCl2轻重
悬细菌,存于4℃,在12~24小时内使用;或加入灭菌的甘油,
使其终浓度为15%(v/v),保存于-80℃。
二、质粒转化
取10µl上述连接产物与50µl感受态细菌混合,冰上放置30
分钟,后放入42℃水浴中热激90秒,迅速取出放至冰上冷却2
分钟,加入500µlLB培养基,摇床200rpm,37℃培养1小时
使细菌复苏。6,000rpm离心5分钟,弃去上清,用100µlLB培养
基重悬细菌沉淀,用接种棒将菌液均匀涂抹在含有氨苄青霉素的固
体培养基上,在超净台中晾干,放在37℃培养箱中过夜培养。第二
天可挑取单菌落接种于4mlLB培养基中过夜培养,送样测序或加
入终浓度为20%的甘油冻存于-80℃
三、质粒提取
取-80℃冻存的菌液50µl或挑取培养皿中的单菌落接种于4
ml含有青霉素的LB培养基中培养8小时,接着扩增至50ml
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