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新手细胞免疫荧光实验常见问题解答

一提到蛋白实验，大家想到最多的就是Westernblot，其实除了

WB，免疫荧光技术也是一项很好的检测蛋白定位和表达的辅助试验。

今天，小六儿想跟大家分享一下自己在做免疫荧光试验的一些经验。

1、细胞密度

细胞密度是整个实验是否能成功的关键点之一。无论是贴壁细胞

还是悬浮细胞，爬片后细胞密度直接影响到后续的荧光拍照效果。

免疫荧光对细胞密度的要求不同于细胞划痕实验。我们在做细胞

划痕的时候，一定要等到细胞长满才可以进行后续操作，但是免疫荧

光并不需要这么多的细胞数量，镜下细胞太多反而会让图像效果很乱，

没有针对性；如果细胞数量太多，产生叠加，也会影响整体荧光效果。

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第一张图可能不是很清楚，玻片四周的细胞较多，中间的细胞较

少。20倍镜下DAPI核染色可见细胞密度较大，其中亮度更显著的地

方很可能是多层细胞叠加的效果。

那么我们该如何控制好细胞爬片时的密度呢？我们需要考虑的到

爬片的尺寸和细胞生长时间。爬片是一个动词，其实就是将玻片放到

培养皿中，让细胞在玻片上生长。

第一点：我们要保证玻片上的细胞以单细胞层生长。

在这一点上，个人认为悬浮细胞很容易被吹打混匀，玻片上的细

胞基本上可以保证处于同一层面。但是贴壁细胞本身很喜欢抱团生长，

所以镜下总是一簇一簇的细胞聚集，这种情况下就很难保证细胞生长

同一层面了。那么我们在做这一步的时候，建议大家用10μl的小枪头

吸取细胞悬液，在25mm的细胞爬片上从玻片外圈向内圈转圈加样

（见下图），这么做相当于在缓慢加样的过程中，玻片上的细胞又完

成了一次从外向内和从内向外的混匀过程，防止某一部位的细胞聚集。

加样结束后，镜下观察细胞初步密度。如果细胞密度过大，可以

将玻片上的细胞悬液吸回再重新稀释；如果细胞密度可以，只是还存

在部分细胞聚集，可以用5ml的注射器针头轻轻拨动细胞悬液，注射

器针头相对于10μl的枪头还是细的，不会破坏细胞形态。

第二点：我们要考虑到细胞生长的速度。

正常细胞放在6cm的培养皿中，可能2-3天才会长满。但是爬片

的面积本身较小，细胞在小面积的爬片上生长速度会更快一些，所以

一般等到爬片上的细胞稳定后，再添加培养基于孵箱内培养12小时就

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可以了。如果时间超过24小时，即使最开始接种密度小，最后也会长

得很满。

第三点：我们要保证爬片是无菌的。

从公司购买的爬片都是经过γ射线灭菌后用锡纸包装的，是可以

直接使用的。使用之前在超净台下照一下紫外就可以了。然而实验中

我们会发现，放置时间较长的爬片会经常黏连，很难分开。造成这种

情况的原因多半是之前使用过的人没有把爬片封存好，接触到空气后，

湿度较大造成的爬片黏连。我们在分离爬片的时候最好选用塑料材质

的镊子（转膜时常用的那种材质），这样的镊子较软，一般不会将爬

片捏碎。每次使用后记得用锡纸包裹好放回专门保存爬片的盒子中。

其实只要保证使用后包裹严密，就不会造成黏连的情况。

2、孵育抗体

IF的抗体和WB的抗体并不都是能通用的，要看具体