禽克雷伯菌病诊断技术规范.docxVIP

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2024-08-30 发布于上海
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禽克雷伯菌病诊断技术规范.docx

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禽克雷伯菌病诊断技术规范

1范围

本文件规定了禽克雷伯菌病诊断的技术方法和诊断结果判定依据。本文件适用于禽克雷伯菌病的诊断、检疫和流行病学调查。

2规范性引用文件

下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本适用于本标准。但是，鼓励根据本标准达成协议的各方研究使用这些文件的必威体育精装版版本。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T541-2016兽医诊断样品采集

保存与运输技术规范、NY/T1948-2010兽医实验室生物安全要求通则。

3符号和缩略语

下列符号和缩略语适用于本文件。

符号缩略语

英文缩写

中文全称

英文缩写

中文全称

营养琼脂

16SrRNA

16S核糖体RNA基因

MAC

麦康凯琼脂

DNA

脱氧核糖核酸

沙门志贺菌属琼脂

PCR

聚合酶链式反应

甲基红

TaqMix

扩增预混液

乙酰甲基甲醇试验

ddH2O

双重去离子水

TSI

三糖铁琼脂

khe

肺炎克雷伯氏菌特异性基因

H2S

硫化氢

枸橼酸盐

4诊断

依据流行病学特点、临床症状及剖检变化等做出初步诊断，确诊需做病原学鉴定。

4.1流行病学

4.1.1在发病前有接触感染禽克雷伯菌的病禽或带菌禽；

4.1.2主要为20日龄以内的幼禽发病。幼年禽发病率和死亡率较高，成年禽类少见发病；

4.1.3发病前有季节交替、环境温度突变、长途运输等应激因素。

4.2临床症状及剖检变化

4.2.1临床症状

表现为精神沉郁，体温升高，呼吸困难。

4.2.2剖检变化

剖检以纤维素性肺炎变化为主。患病幼雏皮下出血，气管黏膜出血，心外膜增厚，肺淤血、水肿、坏死、切面有红色泡沫样液体流出，胸腔有渗出液混有胶冻样物，肝脏坏死、肝包膜增厚、严重的表面覆有一层纤维素性伪膜，脾脏肿大充血，肾脏肿大有出血斑点，肠道充血出血明显，盲肠积粪，脑实质出血。

4.3病原学检测

4.3.1细菌分离培养和涂片镜检操作

无菌采集血液、肝脏、肺脏、脾脏等发病器官病料（病料采集，具体NY/T541要求执行），无菌接种环沾取采集到的病料，划线接种于NA培养基中，37℃培养18h~24h后观察有无菌落生长。挑选单个优质菌落接种于MAC培养基中，选取粉红色、质地粘稠、中等大小的典型单个菌落进行革兰氏染色、镜检，观察细菌的形态。

注：具体NA，MAC培养基配制方法见附录A1,A2。培养形态

在营养琼脂平板上，菌落呈灰白色圆形隆起、边缘整齐、湿润黏稠；在45°斜射光下可见明亮荧光，见附录A3图1；在血琼脂平板上形成浓厚、灰白色、圆凸闪光的菌落，不溶血；在麦康凯琼脂上形成粉红色粘稠菌落，表面湿润，具有扩散性，菌苔密集处菌落呈黄色，见附录A3图2；在SS琼脂上，37℃培养24h后形成粉红色菌落，培养基变为粉红色，培养48h后，菌落及培养基变为黄色。

镜检形态

挑取单个菌落涂片、革氏染色、镜检，观察细菌的形态，应为革兰氏阴性粗短杆菌，单在或成对排列、有荚膜、无芽胞。见附录A3图3。

4.3.2生化试验操作步骤

将纯培养菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖、阿拉伯糖、鼠李糖、木糖、C、尿素、MR、VP、硫化氢、吲哚、明胶、三糖铁等微量发酵管中，37℃培养18h~24h后观察结果。

生化结果

见表格。

生化试验项目

反应结果

生化试验项目

反应结果

葡萄糖

田

枸橼酸盐

(+)

乳糖

田

尿素

(+)

麦芽糖

田

MR试验

（-）

甘露醇

田

VP试验

(+)

蔗糖

田

硫化氢生成试验

（-）

阿拉伯糖

田

吲哚试验

（-）

鼠李糖

明胶

（-）

木糖

三糖铁(TSI)反应

田不产生H2S

注：田表示产酸产气，＋表示产酸不产气，（-）表示阴性，（＋）表示阳性

4.3.3致病性检验及动物回归试验操作步骤

取20只小鼠和20只20日龄雏禽各随机分为2组，即小鼠、雏禽试验组和对照组，每组各10只。对照组，隔离饲养，不做攻菌处理；实验组无菌吸取上述经生化鉴定的分离菌的血清肉汤纯培养物腹腔注射实验组小白鼠和雏禽，每只注射0.3mL（4.05×1011CFU/mL）。注射后小鼠和雏禽隔离饲养，观察发病及死亡情况，并对死亡小鼠和雏禽的心血、脑、肝脏、脾脏进行细菌分离鉴定。

结果

观察到试验组小鼠和雏禽注射24h后应表现出不同程度的精神萎靡，毛皮粗糙竖起，呼吸急促、采食减少等现象；对照组小鼠和雏禽无此现象。攻菌小鼠各组发病率达90%以上，死亡率80%以上；攻