载体的选择和工程菌的构建过程中应注意的问题.pdfVIP

一、获取目的基因

(一)来源

反转录法

反转录-聚合酶链反应法

化学合成法

对已发现的基因的改造

(二)用途

表达

分泌型表达

融合表达

包含体表达

根据目的基因及受体细胞综合考虑表达类型

克隆

二、重组

(一)载体的选择

表达型载体:如pUC18/19,pGEM-T载体

克隆型载体:如pBR322,TA载体

不同要求的目的基因应按照需要,选择正确的载体类型。

(二)重组方法:用T4DNA聚合酶将粘性末端连接起来

(1)黏性末端连接;(2)平末端连接;(3)同聚物接尾连接;(4)接头连接法。

需要考虑的问题:1.克隆基因的酶切位点问题2.载体的酶切问题3.连接片段

浓度比的问题

三、转化

(一)受体细胞(工程菌)的选择

大肠杆菌,枯草杆菌,链霉菌,酵母菌,昆虫细胞(家蚕),哺乳动物细胞(中国仓

鼠卵巢细胞CHO),植物细胞(拟南芥菜、烟叶)

***重组和转化需要共同注意的问题

目的基因的稳定性,酶切位点

载体的酶切位点,选择标记

载体的拷贝数,载体和受体的相容性

受体的表达系统

目的菌对密码子的偏爱

四、筛选

(一)筛选方法

(1)遗传学方法

(2)物理筛选法

(3)核酸杂交法

(4)表达产物分析法

不同的载体,选用的筛选方法不同,应根据所选用的载体上所含的标记基因来

确定。

(二)注意事项(蓝白班筛选法)

1.连接酶用量与DNA片段的性质有关,连接平齐末端,必须加大酶量,一般连接

粘性末端酶量的10-100倍。

2.在连接带有粘性末端的DNA片段时,DNA浓度一般为2-10mgml,在连接平齐

末端时,需加入DNA浓度至100-200mgml。

3.连接反应后,反应液在0℃储存数天,-80℃储存2个月,但是在-20℃冰冻保

存将会降低效率。

4.粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定,所以尽管T4DNA连接酶的最适反

应温度为37℃,在连接粘性末端时,反应温度以10-16℃为好,平齐末端则以15-

20℃为好。

5.在连接反应中,如不对载体进行去5‘磷酸基处理,便用过量的外源DNA片

段(2-5倍),这将有助于减少载体的自身环化,增加外源DNA和载体连接的机会。

6.麦康凯选择性琼脂组成的平板,在含有适当抗生素时,携有载体DNA的转化

子为淡红色菌落,而携有带插入片段的重组转化子为白色菌落。该产品筛选效果同

蓝白斑筛选,且价格低廉。但需及时挑取白色菌落,当时间延长,白色菌落会逐渐变

成微红色,影响挑选。

7.X-gal是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-

D-galactoside)以半乳糖苷酶(b-alactosidase)水解后生成的吲哚衍显蓝色。IPTG

是异丙基硫代半乳糖苷(Isopropylthiogalactoside),为非生理性的诱导物,它可以

诱导lacZ的。

8.在含有X-gal和IPTG的筛选上,携带载体DNA的转化子为蓝色菌落,而携带

插入片段的重组质粒转化子为白色菌落,平板如在37℃培养后放于冰箱3-4小时可

使显色反应充分,蓝色菌落明显。

五、表达

(一)分泌型表达

分泌表达形式的优点:

目的蛋白稳定性高重组人胰岛素原若分泌到细胞周中,其稳稳定性大约是在细

胞质中的10倍

目的蛋白易于分离

目的蛋白末端完整相当多的真核生物成熟蛋白N端并不含有甲硫氨酸残基。

当这些真核基因在大肠杆菌中表达时,蛋白质N端的甲硫氨酸残基往往不能被切

除。如若将外源基因与大肠杆菌的信号肽编码序列重组在一起,一旦分泌型表达,其

N端的甲硫氨酸残基便可在信号肽的剪切过程中被有效除去

分泌表达形式的缺点:

相对其它生物细胞而言,大肠杆菌的蛋白分泌机制并不健全。外源真核生物基

因很难在大肠杆菌中进行分泌型表达,少数外源基因既便能分泌表达,但其表达率通

常要比包涵体方式低很多,因此目前用于产业化的异源蛋白分泌型重组大肠杆菌尽

管有