人民医院基因扩增实验室肺炎支原体核酸定量检测标准操作程序.pdfVIP

人民医院基因扩增实验室肺炎支原体核酸定量检测标准操作程

序

1项目名称

肺炎支原体核酸定量检测

2检验方法名称

TaqMan荧光定量检测

3方法学原理

用一对肺炎支原体特异性引物和一条肺炎支原体特异性荧

光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个荧光报告基团

（R）和一个荧光淬灭基团（Q）。探针完整时，R基团发射的荧

光信号被Q基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活

性将探针酶切降解，使R荧光基团和Q荧光基团分离，Q基团

对R基团的抑制吸收作用消失，荧光监测系统就可接收到R基

团的荧光信号。每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成。

被切割产生的荧光分子数与PCR产物的数量成比例，这样就实

现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。因此根据PCR

反应液的荧光强度即可计算出初始模板的数量。

4标本要求

4.1适用标本类型：痰液、咽拭子等。

4.2标本采集（泌尿生殖道分泌物）

a)痰液—使用一次性吸痰器，患儿取仰头平卧位，将吸痰管

缓缓插入咽喉部，调节负压，将气管深部分泌物（在雾化

吸入后效果较好）缓缓吸入储液瓶中，反复数次，储液瓶

中分泌物即为标本，密封送检。

a)咽拭子—用咽拭子取咽部分泌物（多数会有粘稠的痰液），

将咽拭子置入无菌玻璃管，密封送检。

4.3标本保存：标本可立即用于测试，也可以保存于-20℃待

测，保存期为6个月。

5试剂

5.1试剂名称：肺炎支原体核酸定量检测试剂盒（PCR-荧光

探针法）

5.2生产厂家：中山大学达安基因股份有限公司；

5.3试剂货号：#DA-B064；

5.4包装规格：20人份/盒；

5.5试剂成份：

组成部分数量

DNA提取液（500µl/管）2管

MPPCR反应液（400µl/管）2管

Taq酶（60µl/管）1管

MP阴性质控品（50µl/管）1管

组成部分数量

MP强阳性质控品（50µl/管）1管

MP弱阳性质控品（50µl/管）1管

5

MP阳性定量参考品（1.0×10基因拷贝/ml）1管

10µl/管

6

MP阳性定量参考品（1.0×10基因拷贝/ml）1管

10µl/管

7

MP阳性定量参考品（1.0×10基因拷贝/ml）1管

10µl/管

8

MP阳性定量参考品（1.0×10基因拷贝/ml）1管

10µl/管

5.6试剂储存条件：保存于—20℃，有效期6个月。

6仪器

ABI7500全自动基因扩增检测仪

7操作步骤

7.1DNA提取

7.1.