多重PCR在线粒体基因突变聋病诊断中的应用.pdf

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解放军医学杂志2002年3月第27卷第3期MedjChinPLAVol27No3Mar2002

·技术与方法·

多重PCR在线粒体基因突变聋病诊断中的应用①

李为民韩东一袁慧军王劫勤0

100853北京解放军总医院曹菊

阳扬伟竟匪j因

关键词PCR；线粒体基因组；遗传性耳聋：限制性内切酶1资料与方法

中国图书资料分类号R764

1．1临床资料12个遗传性耳聋家系由解放军总医院耳科门诊

在以往的研究中．作者对大量耳聋家系进行了mtDNA155、及贵卅l省人民医院听力康复中心收集．均为非综台征型感音神经

3243“及7445。突变检测，发现了一些mtDNA突变家系，采用的方性耳聋家系。实验证实这些家系均有mtDNA突变，其中1555突

法主要是PCR扩增、限制性内切酶分析等，并经测序验证方法的变家系l0个，7445突变家系2个。●

可靠性这些方法较繁琐，对于一个病例需要经3次PCR扩增、31．2引物设计按照多重PCR技术要求．设计引物3对：P，

次限村性酶切分析才能得出结论。～。因此．作者探索多重PCR引物二聚体形成，且3对

对mtDNA突变的诊断方法引物之间无互补序列

表1多重~CR引物序列及其扩增片段长度

注：(s)正意义链；(a／反意义链

1．3多重PCR反应扩增以上述3对引物对患者外周血提取30rain(电压60~80V，电流强度20--30mA)，观察酶切结果。

DNA模板进行多重FCR扩增，日的片段为：mtDNA(nt)1278—1．4限制性内切酶分析多重FCR产物10I，在37℃以Alw26

2018、(nt)315~3551、(m)7i5i8523片段。在25I扩增体系中加I、xbaI及AmI(表2)各05gl酶切1h．反应体系中包含：FCR产

^10X缓冲液2．5#1，10mmol／LdNTP1．0ul，3对引物各物10#l，REbuffer2#1，BSA0．2#1．Multi-core0．2ul，同时加3种内

2．Opmol，mtDNA提取液15u,l，用三蒸水补足至24．714．95℃变性切酶并以三蒸水补足至20#1。以1琼脂糖水平凝胶电泳观察酶

5min，加入TaqDNA聚台酶n3#1，FCR反应条件：97℃1min，切反应结果。

6j℃lmin，72℃2rain，共35个循环以1琼脂糖水平凝胶电泳

表2三种限制性内切酶检测位点及其阳／阴性时酶切片段太小(bp)

I_5mtDNA12srRA、tRNA㈣和cRNA…基因序列测定2限制性内切酶分析经多重酶切反应后，可得到mtDNA三

以3对引物分别行常规FCR，反应条件：25ul扩增体系中缓冲种不同突变情况的限村性酶切图谱(图1、2)。对12个家系的多

液曼5#1，2mmol／LdNTP曼5l，一对引物各2．5pmol，mtDNA提重PcR反应检测结果与以往常规PCR检测结果相同。

取液10#1，用三蒸水补足至24．9#1，95℃变性5rain，加入_raqI)＼A3mtDNA基因测序结果发现1555家系10个(懈