蚕沙中果胶叶绿素和黄酮类化合物的综合提取.doc

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蚕沙中果胶、叶绿素、黄酮类化合物的综合提取

摘要在总结前人经验的基础上，对实验方法进行改良，用50%的乙醇从蚕沙中一次性分离提取黄酮类化合物、叶绿素和果胶，并用盐酸-锌试验、抗氧化试验、分光光度计、果胶酶分别对果胶提取物进行分析鉴定。

关键词蚕沙黄酮类化合物果胶叶绿素提取分析鉴定

蚕沙,对于桑蚕而言,是指蚕粪、残桑叶、蚕的蜕皮、糠草等的混合物,可利用的部分是蚕粪。其干品含粗蛋白15%,碳水化合物55%,粗脂肪2.5%(其中色素约0.8%),粗纤维18%,粗灰分9.5%，氮2.97%，磷1.03%，钾3.62%等〔1〕。蚕沙可用作禽畜的饲料，用来喂猪、喂鸡等，也可用作鱼饲料；蚕沙还可用作农家肥料进行施肥，而且还是提取叶绿素、叶黄素、类胡萝卜素、植物醇、叶蛋白、果胶等来源丰富且廉价的原料。果胶可广泛应用于医药、曰用化工、食品、轻纺行业,具有显著的经济效益和社会效益〔2〕。

叶绿素属于卟啉类化合物，存在绿色植物的叶子或微生物体内,在绿色植物和微生物有光合作用中起重要作用。叶绿素衍生物用途广泛,可用来制造光敏剂、催化剂、食用色素、涂料、汽油添加剂和各种卟啉衍生物等。叶绿素是植物叶片内进行光合作用，合成糖类的重要物质成分，在医药、食品及日用化工中应用广泛，根据叶绿素的光吸收特性，叶绿素a和叶绿素b分别于波长645、663nm处有最大光吸收值〔3〕。

黄酮类化合物是一类在植物中广泛分布的活性天然产物，蚕沙中也有黄酮类化合物〔4〕;黄酮类化合物具有抗菌、抗氧化、抗衰老等多种生理活性,对它的利用越来越多受到人们的关注〔5〕。

果胶是一种天然的多糖分子化合物，它主要成分是多缩半乳糖醛酸及其甲酯，用比色法测定蚕沙果胶、高甲氧基果胶、低甲氧基果胶在果胶酶消化后的光吸收值，对比蚕沙果胶的甲基化程度〔6〕。

过去很长一段时间里，蚕沙却不被利用，而是被到处乱堆放，这不但浪费了蚕沙这一宝贵的资源而且也污染了环境；或者蚕沙只是被单一的利用。目前实验研究多为一次性提取果胶或一次性提取果胶和叶绿素,对蚕沙中的果胶、黄酮类化合物和叶绿素的综合提取尚未见有。从蚕沙中提取果胶,黄酮类化合物和叶绿素开展资源的综合利用,变废为宝。

1材料和方法

1.1材料

由蚕桑系提供，经过筛、80℃烘干的五龄蚕沙，95%乙醇（AR），浓盐酸（AR），草酸（AR），精密pH试纸，锌粉，甲基紫、Fe2+溶液、1％H2O2、Tris-HCL（pH5.0－8.0），DNS试剂（3,5-二硝基水杨酸

恒温水浴锅、752型分光光度计。

1.2方法

1.2.1黄酮类化合物及叶绿素的提取

称取10g干蚕沙于烧杯中，加入100mL50%乙醇（由95%乙醇稀释），于水浴锅中85℃左右加热中加热，趁热过滤。滤液分离黄酮类化合物溶液和沉淀叶绿素，滤渣用于提取果胶。

取滤液蒸发酒精至滤液无醇味，放置过夜，分离得到上清液黄酮类化合物溶液和叶绿素沉淀。

1.2.2果胶的提取

在上述滤渣中加入200mL2.5%草酸-草酸铵缓冲液，于85-90℃水浴加热，搅拌40min，乘热用尼龙细布过滤，放入另一烧杯中。压干滤液，冷却至室温后慢慢加入250mL95%乙醇溶液，搅匀，静置0.5h后，抽滤，用少量95%乙醇洗涤滤物，抽干。将滤物置于干燥器中，60℃

2结果

2.1黄酮类化合物的鉴定

2.1.1盐酸-锌定性实验〔7〕

取蚕沙中黄酮类化合物提取液，用蒸馏水稀释至颜色较浅，分2份装入试管，1份加入4-5滴浓盐酸，使其呈酸性；再加入少量锌粉，在沸水中加热3min。另一份作对照。

反应结束后溶液变成红色，证明溶液中有黄酮类化合物存在。

2.1.2黄酮类化合物抗氧化实验〔6〕

利用黄酮类化合物具有抗氧化这一性质，通过测定黄酮类化合物在578nm处的光吸收值，按以下公式：D=[（AS-AO）/（A-AO）]×100%

便可得到黄酮类化合物的阻碍率。

取三支试管，按下列比例加入各种物质，单位：（mL）

试管Ⅰ

试管Ⅱ

试管Ⅲ

甲基紫

1.0

1.0

1.0

Fe2+溶液

1.0

1.0

—

1％H2O2

1.0

1.0

—

Tris-HCL调节pH=4.7左右，并稀释到10mL，摇匀，静置5min

黄酮类化合物提取液

—

5uL

—

578nm下分别测出三支试管溶液的O.D值

溶液的O.D值

A0

As

A

重复以上步骤三次，测得的阻碍率值为：

A0

As

A

D

1

0

0.138

1.035

0.1333

2

0

0.149

1.393

0.1070

3

0

0.098

0.963

0.1018

求出阻碍率的平均值=0.1140

2.1.3黄酮类化合物最大光吸收值测定

取蚕沙中黄酮类化合物提取液，适当稀释，用分光光度计测定在各个光波长下的O.D值，

波长/n