DB15T 3641—2024马铃薯腐烂茎线虫分离、鉴定及培养技术规程.docx

ICS65.020.01CCSB16

15

内蒙古自治区地方标准

DB15/T3641—2024

马铃薯腐烂茎线虫分离、鉴定及培养技术规程

Technicalcodeofpracticeforisolation,identificationandcultureofpotatorotnematodedisease

2024-08-20发布2024-09-20实施

内蒙古自治区市场监督管理局发布

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由内蒙古自治区农牧厅提出。

本文件由内蒙古自治区农业标准化技术委员会（SAM/TC20）归口。

本文件起草单位：内蒙古自治区农牧业科学院、内蒙古自治区植保植检中心、内蒙古农业大学、鄂托克前旗农牧业技术推广中心、鄂尔多斯市农牧技术推广中心。

本文件主要起草人：霍宏丽、融晓君、席先梅、萨其仍贵、李正男、张冬梅、张溪、路奇、苗春乐、纪永祥、尤俊文、陈文晋、张磊、孙平平、张朋飞、王欣、高健、孙佳颖、聂利珍、田晓燕、苏雅杰、杨帆、韩平安、范雅芳、云晓鹏。

马铃薯腐烂茎线虫分离、鉴定及培养技术规程

1范围

本文件规定了所用试剂、培养基及引物序列、样品采集及分离、鉴定、培养和样品保存与处理技术要求。

本文件适用于马铃薯种植区土壤和马铃薯块茎中的腐烂茎线虫的分离鉴定与培养。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T29577腐烂茎线虫检疫鉴定方法

NY/T1121.1土壤检测第1部分：土壤样品的采集、处理和贮存SN/T1132松材线虫检疫鉴定方法

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

马铃薯腐烂茎线虫病potatorotnematodedisease

由马铃薯腐烂茎线虫引起的植物检疫性病害，可导致马铃薯植株叶片黄化、萎蔫，块茎表皮皲裂、干腐等症状，导致马铃薯产量和品质降低。

4试剂、培养基及引物序列

4,1试剂和培养基

葡萄糖、琼脂、0.5%的次氯酸钠、0.5%青霉素、0.5%硫酸链霉素、4%甲醛溶液、10×Buffer(mg2+)、1mg/mL蛋白酶K，2×TaqPCRMasterMix、50×TAE、核酸染料、DL2000DNAMarker。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基。

4.2引物序列

引物序列按照GB/T29577的要求。

5样品采集及分离5.1采集

土壤样品采集应符合NY/T1121.1的规定。取样深度应在15cm～20cm之间，且每份土样重量以500g～1000g为宜。

马铃薯块茎采集方法：收集有腐烂茎线虫病症的马铃薯薯块（见附录A）。5.2分离

将土壤称取50g、块茎切成1cm的小块，采用改进贝尔曼漏斗法进行分离，应符合SN/T1132的规定。

将分离得到的线虫置于显微镜观察，初步挑选出带有口针的寄生性线虫。5.3玻片制备

于65℃水浴锅中处理3min，热杀死线虫后，用4%甲醛进行固定，制成临时玻片备用。

6鉴定

6.1形态学鉴定

使用上述制备好的临时玻片，每个样品各选取20条雌雄虫进行测量，主要测量线虫体长（L）、体宽（W）、口针长度（Stylet）、尾长（tail）、线虫体长与最大体宽之比（a）、线虫体长与体前部至肠前端的距离之比（b）、线虫体长与其尾长比（c）、体前端至阴门的距离×100/体长（V）。显微镜观察，初步明确是否为马铃薯腐烂茎线虫（见附录B）。

6.2分子生物学鉴定

DNA提取：将线虫放入ddH2O清洗，挑取单条线虫放入200μLPCR管中（含8μLddH2O和1μL10×PCRBuffer），液氮中放置1min，85℃加热2min，向PCR管中加入1μL1mg/mL蛋白酶K，56℃加热15min，95℃加热10min，得到DNA提取液，-20℃保存。

以DNA为模板，进行PCR反应，反应体系见表1。

表1PCR反应体系（20μL）

2×TaqPCRMasterMix

10μL

F（10μM）

1μL

R（10μM）

1μL

DNA模板

1μL

ddH2O

补至20μ