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实验一-DNA提取

实验一DNA的小量制备

小量法提取植物基因组DNA（CTAB法）

1实验目的：

随着基因工程等分子生物学技术的迅速发展及广泛应用，人们经常需要提取高

分子量的植物DNA，用于构建基因文库、基因组southern分析、酶切及克隆等，

这是研究基因结构和功能的重要步骤。本实验目的是学习从植物材料中提取和测定

DNA的原理并掌握CTAB提取DNA的方法，进一步了解DNA的性质。

2实验原理

细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物（DNP）的形式存在于细胞核内。

提取DNA时，一般先破碎细胞释放出DNP，再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质，

最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来。DNP与核糖核蛋白（RNP）在不同浓度

的电解质溶液中溶解度差别很大，利用这一特性可将二者分离。以NaCl溶液为例：

RNP在0.14mol/LNaCl中溶解度很大，而DNP在其中的溶解度仅为纯水中的1％。

当NaCl浓度逐渐增大时，RNP的溶解度变化不大，而DNP的溶解则随之不断增加。

当NaCl浓度大于1mol/L时，DNP的溶解度最大，为纯水中溶解度的2倍，因此通

常可用1.4mol/LNaCl提取DNA。为了得到纯的DNA制品，可用适量的RNase处

理提取液，以降解DNA中搀杂的RNA。

关于植物总DNA的提取主要有两种方法：

1．CTAB法：

CTAB（十六烷基三甲基溴化铵，hexadecyltrimethylammoniumbromide,简称

CTAB）：是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，它能与核酸形成复合物，在高盐溶

液中（0.7mol/LNaCl）是可溶的，当降低溶液盐的浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）

时从溶液中沉淀，通过离心就可将CTAB与核酸的复合物同蛋白、多糖类物质分开，

然后将CTAB与核酸的复合物沉淀溶解于高盐溶液中，再加入乙醇使核酸沉淀，

CTAB能溶解于乙醇中。

2．SDS法：

利用高浓度的阴离子去垢剂SDS（十二烷基磺酸钠，Sodiumdodecylsulfate,简

称SDS）使DNA与蛋白质分离，在高温（55～65℃）条件下裂解细胞，使染色体

离析，蛋白变性，释放出核酸，然后采用提高盐浓度及降低温度的方法使蛋白质及

多糖杂质沉淀，离心后除去沉淀，上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用

乙醇沉淀水相中的DNA。一般生物体的基因组DNA为107~109bp，在基因克隆工

作中，通常要求制备的大分子DNA的分子量为克隆片段长度的4倍以上，否则会

由于制备过程中随机断裂的末端多为平末端，导致酶切后有效末端太少，可用于克

隆的比例太低，严重影响克隆工作。因此有效制备大分子DNA的方法必须考虑两

个原则：（1）尽量去除蛋白质、RNA、次生代谢物质（如多酚、类黄酮等）、多糖

等杂质，并防止和抑制内源DNase对DNA的降解。（2）尽量减少对溶液中DNA的

机械剪切破坏。

几乎所有的DNase都需要Mg2+或Mn2+为辅因子，故实现（1）尽量去除蛋白

质的要求，需加入一定浓度的螯合剂，如EDTA、柠檬酸，而且整个提取过程应在

较低温度下进行（一般利用液氮或冰浴）。为实现（2）需要在DNA处于溶解状态

时，尽量减弱溶液的涡旋，而且动作要轻柔，在进行DNA