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pET载体

pET载体,原核表达金标准

对于全世界许多研究者,Novagen的

pET系统已成为在大肠杆菌中蛋白表达的首

选。该系统成功的一个主要原因是目标基因被克

隆到不为大肠杆菌RNA聚合酶识别的T7启

动子之下,因此在加入T7RNA聚合酶之前几

乎没有表达发生。克隆到pET载体的基因实际

上是被关闭的,不会由于产生的蛋白对细胞有毒

性而引起质粒不稳定。重组质粒转移到染色体上

含有一拷贝由lacUV5控制的T7RNA聚合

酶基因的表达宿主中,并通过加入IPTG诱导

表达;也可通过lCE6感染原始克隆宿主菌来

提供T7RNA聚合酶。使用大肠杆菌启动子系

统(如tac、lac、trc、pL)有困难的许

多基因已经在pET系统中稳定克隆和表达。

T7RNA聚合酶的选择性和活性使得几乎所有

细胞资源都用于为目标基因表达。诱导后几小时

目标产物就可超过细胞总蛋白的50%。

新开发的T7驱动表达技术以pETBlueTM

系统为代表。pETBlue载体包括了pET用于

表达的优点,在目标基因克隆和质粒DNA操作

的方面更为方便。

pETBlueTM系统:新一代T7表达载体

pETBlue载体代表了新型表达载体,它具备所

有广受欢迎的克隆载体的最理想特点和T7驱

动蛋白表达的完全功能。目标基因以相对于修饰

的大肠杆菌tet启动子的反义方向插到lacZa

-肽编码区,因此可进行蓝/白斑筛选。正确定

位于目标基因正义方向上游的T7转录和翻译

信号使表达成为可能。与标准pET载体一样,

通过转化λDE3溶原菌并用IPTG诱导或通

过lCE6感染原始宿主菌生产目标蛋白。

优点

·蓝/白斑筛选,便于克隆

·高拷贝数,质粒DNA高产

·以AccepTorTM载体或perfectlyBlunta

载体形式提供,便于快速PCR克隆

·目标基因无基础水平表达,消除了毒性基因产

物相关的质粒不稳定性

·表达水平与经典pET载体相同

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