GFP基因在DH5a大肠杆菌中的转化与复制.pdfVIP

doc4/27/2022

GFP基因在DH5ａ大肠杆菌中的转化

与复制

许章磊石俊

（指导老师：郜金荣）

摘要：【目的】研究ＧＦＰ基因通过与Ｔ载体的连接在ＤＨ５ａ大

方法】

肠杆菌中的转化与复制。【将PCR扩增后的ＧＦＰ目的基因与Ｔ

载体在体外利用Ｔ４DNA连接酶连接成重组的环状质粒再转导入感受态的ＤＨ

５ａ大肠杆菌中，最后在含有氨苄青霉素的ＬＢ培养基上筛选培养，并提取相

应重组质粒用凝胶电泳检测其碱基对大小。【结果】PCR产物凝胶电

泳条带在700bp左右；重组的大肠杆菌在LB培养基上正常生长的菌落较多，而

在含有氨苄青霉素的ＬＢ培养基上正常生长的菌落却极少；菌落无荧光反应。

【结论】PCR产物为GFP基因；与GFP基因可成功与T载体链接并在ＤＨ

５ａ大肠杆菌中稳定复制并且T载体自身有表达含抗氨苄青霉素的基因，GFP

基因在ＤＨ５ａ大肠杆菌只复制并没有表达（T载体无启动子）。

关键词：GFP基因；T载体；ＤＨ５ａ大肠杆菌；克隆

０引言

【研究的意义】ＧＦＰ基因是一种可在生物体内发绿色荧光的

报告基因，通过与人工载体的链接，并转化到其他生物中，是该基因

随受体细胞一起扩增表达，从而达到培育出具有研究、观赏、经济等

作用的生物产品。本实验是将ＧＦＰ基因与T载体体外链接，然后在

转化到ＤＨ５ａ大肠杆菌中，使其扩增表达。但由于T载体并非表达

1

doc4/27/2022

载体（无启动子），所以重组的大肠杆菌并不能长出肉眼可见的荧光

菌落，但是通过对该操作流程的熟悉与掌握，对为其成功的在大肠杆

菌中的表达甚至在其他高等生物体内的表达提供了理论和实践基础

的依据。

１材料与方法

1.1材料

完整ＧＦＰ基因、上游引物、下游引物、Ｔａｇ酶、ｄNTP、

DH5a大肠杆菌、Ｔ载体、Ｔ４DNA连接酶、ＬＢ培养基（固体和液体）、

氨苄青霉素、CaCl、及各种Buffer等。

2

PCR仪、离心机、恒温摇床、无菌操作台恒温水浴锅、冰箱等。

1.2GFP基因的PCR

○按下列顺序依次加入PCR灭菌的管中：

1

模板DNA（GFP基因）1ul

ddH2O18ul

10XBuffer2.5ul

4种dNTP2ul

上游引物0.5ul

下游引物0.5ul

Tag酶0.5ul

共记25ul

○按以下PCR程序进行扩增：

2

0

94C5min（变性）

2

doc4/27/2022

0

94C45s（30个

0

53C45s循环）