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感受态细胞的制备

—LB液体培养基：胰蛋白胨，1%（W/V）；酵母提取物，0.5%（W/V）；NaCl，

1%（W/V），用固体NaOH调节pH为7.0~7.2，分装于三角瓶中，灭菌后存于

室温。摇动三角瓶，如果发现变浑浊，表明已染菌，应弃掉重新配制；

—0.1mol/LCaCl：称取1.47gCaCl•2H0（Amresco分装）溶于100mL去离子

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水中，灭菌后存于4℃；

—离心管（50mL或80mL或100mL），灭菌；

—培养试管，灭菌；

—1mL枪头，灭菌；

—1mL加样枪；

—滤纸，用牛皮纸包好后灭菌；

—10mL量筒，灭菌；

—5mL移液管，用棉花塞入管口，卷于报纸中灭菌；

—冰，离心管架；

—恒温摇床，可见分光光度计，玻璃比色杯。

1．接种空白大肠杆菌于3mLLB培养基中，37℃剧烈震荡培养过夜；

2．将已培养好的种子液转入100mLLB培养基中扩大培养至OD=0.3后，将

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培养好的细菌置于冰上冷却10min；

3．4℃，4000rpm离心10min收集细菌，倒出上清，将离心管倒置于一干净滤

纸上，将培养基控干；

4．用40mL冰预冷的CaCl悬浮细菌，用加样枪冲吸，使菌体尽可能分散。冰

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上放置30min；

5．4℃，4000rpm离心10min收集细菌，倒出上清，再用4mL冰预冷的CaCl2

悬浮细菌，这些细菌可以立即使用，或者于4℃放置12~24h以增加其敏感性

后使用。

6．如果证明所制备的感受态细胞可用，可以在冰上分装为100μL每管，再加入

100μL甘油（注意：甘油非常黏稠，吸取时应该多一点。），于液氮或-70℃冰

箱中存放。存于低温下的感受态细胞，一定不能融解。如果已经融解，应丢弃，

而不能再冻结保存而继续使用。

注意事项：

1．本实验室所用空白大肠杆菌菌株为JM109。空白菌可以于平板上划线后，用

Parafilm包好后存于4℃，也可将液体培养物存于4℃。但如果要长期保存，

则应将细菌保存于50%的甘油中，存于-20℃或-70℃。当接种的细菌是来自于

-20℃或-70℃存放的液体培养物时，接种应迅速，不等解冻，立即从表面刮下

一块冰后，将菌种迅速放回低温存放；

2．一般于3mLLB培养基中过夜培养12h后，菌体已很浓，可以进行扩大培养。

于100mL培养基中培养2~3h后，即可达到对数生长期。但有时如果由于存

放过久，或者已经过数次解冻，造成细菌生活力下降，则倍增时间会延长；

3．对OD值的监测，当肉眼看到菌体已很浓时，于超净台上取3mL测OD值。

开始可以每30分钟检测一次，越到后面检测的时间就应该缩短；

4．感受态细胞的制备应该再严格无菌的条件下进行。因此，所有操作均应在超

净台上。也可以在实验台上进行，但应在后面放一酒精灯，所有操作都不能远

离火焰。最好每次恰好做感受态之前，将所有的枪头和管子都灭一下菌，用酒

精棉球将加样枪的前端擦拭一遍；

5．感受态细胞的细胞膜比较脆弱，因此一当用冰冷的CaCl悬浮以后，即不能

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剧烈震荡或快速抽吸；

6．根据我们的经验，纯度较高的含结晶水的CaCl可以得到好的实验结果；

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7．所有的枪头和管子均应干净。如果有可能，都尽量用新的。如果是用的回收

的枪头，一定要看管壁是否干净。

8．扩大培养用的液体培养基体积可以调整。调整后的CaCl溶液体积也按比例