ELISA实验操作中常见问题分析.pdfVIP

ELISA实验操作中常见问题分析

严峻溶血，以HRP为标记的ELISA测定中，残留在孔内的血红蛋

白具有过氧化物酶样活性，催化底物显色造成假阳性；混有红细胞的血清

易沉淀或附着在聚乙烯孔内不易洗净；如有细菌污染，菌体中可能含有

内源性HRP，也会产生假阳性反应；标本凝固不全，有时为了争取时刻

快速检测，常在血液还未开始凝固时即强行离心分离血清，使血清中仍残

留部分纤维蛋白原，在ELISA测定过程中能够形成肉眼可见的纤维蛋白块，

易造成假阳性结果；采血试管洗涤不完全、反复使用易交叉污染；塑料

试管能吸附抗原物质，样本久置在塑料管内会使样本内抗原含量下降造成

假阴性。

2、试剂的阻碍

a.分子量大。合成肽采纳化学方法制备，由于工艺的局限，合成数量有

限，只能达到数百个氨基酸；而利用基因工程制备的抗原，分子量更大。

d.纯化难度大。基因工程抗原的纯化技术难度较大。

合成多肽抗原是按照蛋白质抗原分子的某一抗原决定簇的氨

基酸序列人工合成的多肽片段。合成肽抗原有以下特点：a.分子量太小；b.

一样只含有一个抗原决定簇；c.纯度高；d.稳固性差。

国内乙肝两对半试剂厂家较多；不同厂家出产的试剂灵敏度

与特异性存在一定的差别，资料显示，不同厂家试剂的特异性和敏锐性分

别为89.4%—99.3%,78%—89%存在较大差异。有的厂家酶标板孔间A值差

大于15%；标记酶的活性及显色液的稳固比较差。使用质劣的试剂必定导

致结果的假阳性或假阴性。因此。选择高质量的试剂是保证结果准确的关

键之一。

•选择试剂时应选择灵敏度高、特异性好、稳固性好、批间差小、

操作方便省时的优良检测试剂，国家参比实验室每年对各厂家的试剂进行

质量评估并定期公布评估结果，可作为选择试剂的要紧依据。

•要注意试剂的批号和出厂日期，尽管试剂的有效期多为1年。最

好选择刚出厂的试剂使用。

不同厂家的试剂不能混用。

不同方法学的检测试剂，会使两对半结果显现一些不同。例

如：在实际工作中常用ELISA检测HBsAg结果为阴性，而电化学发光检

测为阳性。除方法学的灵敏度外；还存在使用单抗或多克隆抗体试剂的差

别。单抗对变异抗原或亚型乙肝标志物检测存在差异，建议试剂厂家对剂

的制备应该考虑亚型及型浓度的咨询题。

3、操作技术的阻碍

⑴严格按照试剂讲明书进行操作。操作前将试剂在室温下平稳30～6

0min。

⑵加样后及时放人孵箱。标本较多时，要分批操作。按讲明步骤严格

操纵操作时刻，防止孵育时刻人为延长，导致非特异性结合紧附于反应孔

周围，难以清洗完全。

(3)封板温育时，各孔一定要封严，防止阳性标本的液体蒸发，产生周

边现象从而导致“花板”的显现。

(4)用洗板机洗板时，保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好

在吸水纸(选择洁净、无或少尘的吸水材料)上轻轻拍干：还要防止针口有纤

维蛋白或异物，这些异物在洗板的过程中易产生拖带现象而导致“花板”

的显现。

(5)合理安排检测量，以免反应板过多造成洗板等待时刻长。

(6)加酶试剂后用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干。

(7)显色剂尽量在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝色

的TMB显色剂不用。

(8)加样时保持显色剂不外流；A、B液应幸免接触金属器械。加终止液

时应幸免产动气泡。

(9)应保证酶标板清洁，整个操作过程中保证酶标板不接触次氯酸。以

上的措施能够使“花板”降至最低限度。从而提升检测的特异性。并得到

更准确、可靠的实验结果。

加样吸嘴的洁净与否和吸量的准确性，直截了当阻碍检测结

果。由于吸嘴构造专门，导致清洗困难，加大了交叉污染的机会。建议用

一次性吸嘴。加样器也要经常清洗，定期校准。加样时应将所加物加在E

LISA板孔的底部，幸免加在孔壁上部，并注意不可溅出。

洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却决定着实验

的成败。ELSIA确实是靠洗涤来达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。

通过洗涤以清除残留在板孔中没能与固相抗原或抗体结合的物质，以及在

反应过程中非特异性地吸附于固相载体的干扰物质。聚