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绵羊Toll样受体7基因多态性分析

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梁田++杨霞++张勋++肖媛媛++陈新凯++宋佳玮++盛金良

摘要：对新疆萨福克羊Toll样受体7基因单核苷酸进行多态性分析，探索绵羊TLR7基因多态性与抗病力的关系，为家畜抗病育种提供候选分子标记。采集新疆地区种羊场萨福克羊血液600份，提取DNA，设计扩增引物进行聚合酶链式反应-单链构象多态性（PCR-SSCP）检测，对突变位点进行测序分析。结果表明，12对扩增引物中，第2、5、6、7对引物扩增产物具有多态性。其中第2对和第7对引物扩增产物存在错义突变，第5对和第6对引物扩增产物存在同义突变。经SSCP分析，第2对引物扩增产物表现为3种带型，第7对引物有2种带型.经序列比对分析存在A343G、A350G、A1244G的错义突变，氨基酸改变分别是Lys突变为Gln，Asp突变为Ser，Glu突变为Arg，且突变都发生在胞外区亮氨酸重复区内。其中第2对引物的带型AB是位点A343G和A350G同时发生突变。位点A343G的突变频率最高为45.0%，A350G突变频率12.0%，而A1244G突变频率为5.8%。检测的突变可能改变TLR7基因的功能，进而影响其对病源的免疫应答。为进一步的疾病相关的研究奠定基础，以调查这些研究结果在家畜育种方面的用处。

关键词：Toll样受体7；多态性；萨福克羊；基因型

：S826.2文献标志码：A：1002-1302（2017）08-0026-04

先天性免疫系统是生物进化过程中1种比较古老而保守的防御体系，是抵御病原微生物感染和有害物质侵害的第一道防线，而广泛模式识别受体（patternrecognitionreceptors，PRR）[1]是先天性免疫系统执行识别潜在的病原微生物和非致病性共生菌群，并清除病原微生物的重要受体。PRR包括NK细胞活化受体、清道夫受体、甘露糖受体和Toll样受体（Tolllikereceptors，TLRs）。这些受体中，TLRs是最为重要的受体，能够识别不同病原微生物所携带的特异性结构成分，即病原相关分子模式（patho-gen-associatedmolecularpatterns，PAMPs）。在家畜中，已经检测到10种功能性TLR基因[2]。TLR3、TLR7、TLR8、TLR9能够识别细胞内的病原体表达的配体。其中TLR7属于Ⅰ型跨膜蛋白受体，具有与其他TLR家族成员共同的结构特征，其分子结构由胞外区、跨膜区和胞内区组成。其存在于多种细胞中，包括浆细胞样树突状细胞（pDC）、巨噬细胞、T细胞、B细胞等免疫细胞，嗜酸性粒细胞、中性粒细胞和内皮细胞中也有一定水平的表达[3-5]。另外，在扁桃体、脾、胎盘、骨髓、肺和淋巴结等组织中也有表达[6]。1996年，Hofmann等证实克隆果蝇Toll样受体能识别并抑制真菌繁殖[7]。随后，人们发现Toll样受体在天然免疫系统和获得性免疫中起着重要的作用。TLRs信号转导途径主要包括依赖MyD88的信号通路和非依赖MyD88的信号通路。TLR7能够通过依赖MyD88的信号通路激活免疫细胞，并诱导免疫细胞表达高水平的干扰素、肿瘤坏死因子-α、IL-12等细胞因子，介导抗病毒免疫。TLR7胞外区负责识别和接受相应信号，随后TIR位点招募富含Toll/白介素1受体接头蛋白分子，启动下游信号分子，最终杀伤感染的病原体[8-9]。通过TLR7的作用，机体能激发天然免疫与获得性免疫，有效地防御来自外部环境的病原体感染，维持机体内环境的稳定。

基因多态性与机体对疾病的遗传易感性相关。Toll样受体在识别病原微生物启动免疫应答中起重要作用。越来越多数据表明，TLRs单核苷酸多态性与炎性应答损伤及感染性疾病的遗传易感性相关，如TLR4基因Asp299Gly和Thr399IleSNPs与多种感染性疾病正相关，在动脉粥样硬化及其相关疾病中则起保护作用[10]。研究表明，当动物面对体外环境（空气灰尘较多）和体内环境（细菌入侵）的变化，会作出适应性反应，由于TLR配体可能会受到Toll样受体基因单核苷酸多态性的影响，导致对细菌感染或炎症性疾病易感性的改变[11]。目前，绵羊TLRs的多态性研究较少，其与疾病关系还不十分清楚。本研究通过PCR-SSCP分析及其基因突变频率分析，研究绵羊Toll样受体7胞外区基因的多态性，为今后绵羊育种的标记辅助选择提供确切的遗传学证据。

1材料与方法

1.1主要试剂与仪器

丙烯酰胺、双丙烯酰胺、TEMED、2×TaqPCRMasterMix，均购自上海生工生物工程有限公司；DNA提取试剂盒购自北京天根生物工程有限公司；DNA凝膠回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司。其他常规试剂来自于石河子大学动物科技学院病理实验室