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基因打靶技术及其应用前景

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乔德瑞朱芷葳

摘要:基因打靶技术是一项新兴的分子生学技术,综述了基因打靶技术的原理、操作以及应用与研究进展。

关键词:基因打靶;同源重组;打靶载体;打靶效率;筛选系统

:Q78:A:1007-5739(2009)20-0368-02

基因打靶是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,是利用基因转移的方法,将外源DNA序列导入靶细胞后,通过外源DNA序列与靶细胞内染色体上同源DNA序列间的重组,将外源DNA定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点,或对某一预先确定的靶位点进行定点突变,从而改变细胞遗传特性的方法[1]。作为一项新兴的技术,基因打靶有着其无可比拟的优点:基因打靶所适应的细胞既可以是原核细胞,也可以是真核细胞;基因打靶能把外源基因引入染色体DNA的特定片段上;在设计合理的情况下,基因打靶可对宿主细胞染色体基因进行精细的改造;基因打靶后被击中的基因或新引入的基因随染色体DNA的复制而稳定复制[2]。目前,基因打靶技术已应用在改造生物,培育新的生物品种,研究基因结构与功能、表达与调控,研究细胞生活周期调控机制,遗传病的基因治疗等方面。尽管还存在着一些技术问题,但随着研究的深入,基因打靶技术正在不断发展与完善。

1基因打靶技术的原理

进行基因打靶,首先要设计和合成一个靶载体。该载体不仅含有需要插入的DNA序列,其两端还含有与靶基因座上的序列相同的核苷酸片段,即同源重组指导序列[3]。将此载体用基因转移的方法导入靶细胞。通过外源载体和内源靶位点相同的核苷酸序列之间的同源重组,使外源DNA定点整合到靶细胞特定的基因座上。同源重组的分子机制目前尚未阐明,但已相继提出了多种解释同源重组的模型,其中Meselson—Radding模型不仅可以解释交互重组的现象,而且还可以圆满地解释基因转变现象,因此被广泛接受[4-6]。但Szostak等提出的双链断裂修复模型(DSBR)能更好的解释双链断裂可以大大提高同源重组的效率这一现象[7]。

2基因打靶的操作

2.1基因打靶载体的构建

基因打靶载体包括载体骨架、靶基因同源序列和突变序列及选择性标记基因等非同源序列,其中同源序列是同源重组效率的关键因素,基因打靶载体的同源重组序列一般可通过特异性探针从基因组DNA文库中分离得到,也可以利用PCR对基因组目标的DNA序列进行扩增得到[8]。

基因同源重组的发生依赖于同源序列的长度,目前认为30～40bp的同源序列长度将是同源重组发生的保险线。实验表明,在哺乳动物细胞内,当同源序列长度在295～1800bp之间时,重组率与同源序列长度呈正比,当同源序列长度在200bp以下时,重组效率明显降低。这对选择合适的同源重组指导序列长度具有重要的指导意义[9]。一般情况下,同源重组指导序列为基因组DNA而不用cDNA,以免造成基因组缺失或形态改变。

基因打靶载体有基因插入型载体和基因置换型载体2种类型。插入型载体与靶基因同源的区段中含有特异的酶切位点,线性化后,同源重组导致基因组序列的重复,从而干扰目标基因的功能。置换型载体进行线性化的酶切位点在引导序列和筛选基因的外侧,线性化后,同源重组使染色体DNA序列被靶载体序列替换。大多数基因敲除突变都采取置换型载体进行基因打靶。

外源DNA导入的方式主要有显微注射法、电穿孔法、精子载体法和逆转录病毒法等[10]。目前应用最广泛的是显微注射法。逆转录病毒载体法利用某些病毒与组织细胞有特异的亲合力,可用于时空特异性的基因打靶,在人类疾病的基因治疗方面具有较大的发展潜力。

2.2受体细胞转化

由于在同源序列附近的DNA有双链断裂能促进同源重组,因此在完成打靶载体的构建后,以限制性酶线性化载体并已去除质粒部分,用电穿孔、显微注射、DNA—磷酸钙共沉淀、脂质体包装和PEG介导等方法把上述重组DNA片段转入受体细胞核内[11]。

2.3筛选

基因打靶的筛选系统多种多样,现今采用的一般有:①选择标记基因定点突变的筛选;②正向选择法;③无启动子筛选法;④正负筛选法。这里主要介绍正负筛选法[12]。

用选择培养基筛选已击中的细胞,筛选通常使用正、负选择法。构建载体时,在靶基因的同源序列中插入正选择标记,在同源序列之外的γ末端,甚至γ和ζ2个末端接上负选择标记。转化受体细胞的过程中如果所导入的重组DNA与受体细胞基因组DNA发生非同源重组,则外源基因通常是从头至尾均整合进入受体细胞基因组中,此时正、负筛选标记基因同时表达,若为同源重组,外源目的基因及正选择标记会整合到受体细胞基因组同源序列的基因座上,而位于同源序列外端的负选择标记基因则在重组后丢失[13,14]。因此时仅有正筛选标记基因表达。例如,实验室常以新霉素抗性记忆(neo)为正标记基因,以单纯疱疹病毒的