02-实验二--还原糖和总糖的测定(3-5-二硝基水杨酸-DNS)(考核15%).pptVIP

实验二还原糖和总糖的测定（3,5-二硝基水杨酸法）掌握还原糖和总糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸（DNS）测定还原糖的方法。一、实验目的单糖和部分寡糖含有醛基或酮基，具有还原性，属于还原糖；多糖和蔗糖属于非还原性糖。多糖能被酸水解为单糖，通过测定水解后单糖的含量可以测定总糖。二、实验原理还原糖与DNS在碱性条件下反应，糖被氧化成糖酸，DNS被还原成3-氨基-5-硝基水杨酸，显棕红色，最大吸收波长540nm。在较低浓度范围内，还原糖浓度与吸光度值呈线性关系，可以测定还原糖和总糖的含量。显色反应黄色棕红色三、实验器材1.材料：红薯2.试管1.5cm×15cm3.移液管1.0mL、5mL、10mL4.水浴锅5.电炉6.分光光度计7.离心机8.容量瓶100mL9.量筒、研钵、三角烧瓶10.分析天平四、实验试剂1.葡萄糖标准液（1.0mg/mL）：100mg葡萄糖，用水定容至100mL，4℃保存。2.DNS：6.3gDNS和262mL2.0mol/LNaOH溶液，加到500mL含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，加5.0g结晶酚和5.0g亚硫酸钠，搅拌，冷却后用水定容至1000mL，棕色瓶中存储。五、操作步骤1.葡萄糖标准曲线的制作取6支试管，按下表操作。吸光度为纵坐标，浓度（mg/mL）为横坐标，作标准曲线。管号试剂012345标准葡萄糖溶液（mL）00.10.20.30.40.5蒸馏水（mL）1.00.90.80.70.60.5DNS（mL）2.02.02.02.02.02.0沸水加热5min，取出，冷却至室温。蒸馏水（mL）5.05.05.05.05.05.0A540nm2.还原糖提取取1.00g红薯，加2mL蒸馏水,在研钵中匀浆，加20mL蒸馏水，混匀，倒入三角烧瓶，用20蒸馏水清洗研钵，倒入三角烧瓶。将三角烧瓶放在50℃水浴中保温15min，每隔5min震荡一次。将提取液（含沉淀）转移到50mL离心管中，6000rpm离心3min，上清倒入100mL容量瓶，沉淀用30mL蒸馏水清洗，离心3min，上清倒入100mL容量瓶，用蒸馏水定容至100mL，混匀后作为还原糖待测液。2.还原糖提取取1.00g红薯，加2mL蒸馏水，在研钵中充分匀浆，加20mL蒸馏水，混匀，倒入三角烧瓶，用20蒸馏水清洗研钵，倒入三角烧瓶。将三角烧瓶放在50℃水浴中保温15min，每隔5min震荡一次。将提取液（含沉淀）转移到50mL离心管中，6000rpm离心3min，上清倒入100mL容量瓶，沉淀用30mL蒸馏水清洗，离心3min，上清倒入100mL容量瓶，用蒸馏水定容至100mL，混匀后作为还原糖待测液。3.总糖的水解及提取取1.00g红薯，加2mL蒸馏水，用研钵充分匀浆，倒入三角烧瓶中，用8mL蒸馏水润洗研钵，倒入三角烧瓶中。加入10mL6mol/LHCl，在沸水浴中加热20min，取出2滴置于白瓷板上，加1滴I2-KI溶液，如果不显蓝色，多糖已水解完全。冷却至室温，加1滴酚酞指示剂，用6.0mol/LNaOH和至溶液呈微红色，转入100mL容量瓶，用蒸馏水定容。混匀后过滤，取滤液10mL加入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。混匀，即为稀释1000倍的总糖水解液，用于总糖测定。管号试剂空白还原糖待测液总糖待测液待测溶液（mL）01.01.0蒸馏水（mL）1.000DNS（mL）2.02.02.0沸水加热5min，取出却至室温。蒸馏水（mL）5.05.05.0A540nm4.样品测定按照下列公式计算红薯还原糖的百分含量。六、结果计算?(还原糖)=C×Vm×稀释倍数×100%?：还原糖的质量分数（%）C：还原糖的质量浓度（mg/mL）V：样品提取液的总体积（mL）m：样品的质量（mg）