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“细胞工厂”制备N-乙酰氨基葡萄糖研究进展

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祁康陈建华

摘要:N-乙酰氨基葡萄糖((N-acetylglucosamine,GlcNAc)作为一种功能性糖,能够发挥许多重要的生理功能,在医药、食品工业以及化妆品等行业具有广泛的应用。随着人们环境保护意识的日益增强以及合成生物学的蓬勃发展,针对GlcNAc制备方法不断推陈出新,本文对此进行总述。

关键词:N-乙酰氨基葡萄糖;合成生物学;制备

GlcNAc是氨基葡萄糖(glucosamine,GlcN)的衍生物,分子式C8H15NO6,系统命名为2-(乙酰基氨基)-2-脱氧-D-葡萄糖。目前,GlcNAc制备方法中比较成熟且大规模应用到工业上主要是化学法。由于GlcNAc是多种甲壳类动物(螃蟹和虾为主)表皮中甲壳素的基本成分,常利用强酸(包括盐酸和硫酸)水解贝壳获得不同形式的GlcN。但受限于原材料以及大量强酸使用对环境的损害,该方法显然不可持续。

随着代谢工程以及合成生物学技术的蓬勃发展,人们可以通过合理的规划设计,利用“细胞工厂”制备所需化合物。文献中已经大量报道利用不同微生物作为“细胞工厂”制备GlcNAc,具体指以廉价的葡萄糖作为碳源,通过微生物发酵制备所得。因其高效、环保和可持续,表现出良好的应用前景。

(1)大肠杆菌制备GlcNAc

生物法制备GlcNAc的研究首先在大肠杆菌中进行,大肠杆菌作为一种模式菌株,其遗传背景是清晰的。Deng等人[1]首先通过过表达来自大肠杆菌自身氨基葡萄糖合酶基因(glmS)和来自酿酒酵母的N-乙酰氨基葡萄糖合酶基因(gna1),增强GlcNAc合成途径。接着利用易错PCR筛选出不受产物GlcN-6-P抑制的Glms突变体。又进一步敲除负责胞内GlcNAc降解途径的关键基因(nagA/nagB)以及将GlcN/GlcNAc从胞外重新转运至胞内的nagE和manXYZ基因。在1L发酵罐中产量达到了110g/L。随后的研究发现,对糖酵解途径关键酶之一的丙酮酸激酶编码基因pykA和pykF分别敲除,都能够有利于产量的提高,pykF效果更明显。但同时敲除pykA和pykF,产量下降明显。可能是因为丙酮酸激酶作为糖酵解途径关键调控之一,完全阻断会影响菌体生长,从而最终影响产量[2]。

(2)枯草芽孢杆菌制备GlcNAc

因大肠杆菌为非安全菌株,同时易受噬菌体侵染。研究人员又将目光转向了遗传背景清晰且作为安全菌株的枯草芽孢杆菌。刘龙等[3]首先共过表达了来源酿酒酵母的gna1基因和枯草芽孢杆菌自身的glmS基因,增强GlcNAc的合成途径。随后,同样敲除nagP基因(编码GlcNAc特异性的磷酸转移酶系统)、nagA基因(编码GlcNAc-6-P脱乙酰酶)和gamA/nagB基因(编码GlcN-6-P脱氨酶)。进一步采用模块代谢分析法将相关代谢通路分成三个模块,即GlcNAc合成途径、糖酵解途径和肽聚糖合成途径。利用干扰技术弱化糖酵解途径和肽聚糖合成途径的关键基因表达,使得更多碳源流向GlcNAc合成途径。[4]此外,利用启动子工程对glck基因(编码葡萄糖激酶)和pgi基因(编码磷酸葡萄糖异构酶)进行一系列组合优化[5];对相关副产物(包括乳酸、乙酸以及乙偶姻[6])代谢途径的阻断,这些做法都能促进GlcNAc产量的提高。

(3)其他微生物制备GlcNAc

除了上述最常用的“细胞工厂”,还研究了利用工业上大规模发酵生产氨基酸的谷氨酸棒杆菌制备GlcNAc。谷氨酸棒杆菌在食品安全指标上更有优势,代谢路径也比较简单。刘龙等[7]在谷氨酸棒杆菌S9114中过表达自身的glms基因和来自秀丽隐杆线虫的GNA1基因;敲除编码GlcNAc-6-P脱乙酰酶的nagA基因和编码GlcN-6-P脱氨酶的gamA基因,以阻断GlcNAc在胞内的代谢;敲除编码乳酸脱氢酶的ldh基因,以阻断副产物乳酸合成途径。最终,GlcNAc的产量达到了6.9g/L。

展望

N-乙酰氨基葡萄糖作为一种具有重要生理作用的单糖,其在医药和化妆品行业被广泛应用。受到当前人口老龄化日益严重以及对化妆品需求不断增加的影响,人类对GlcNAc的需求也将不断增加。化学法制备GlcNAc虽能大规模生产,但其对环境危害严重,与现今可持续发展理念背道而驰。显然,利用“细胞工厂”制备GlcNAc具有更加高效、更加环保和更加可持续等优点。在各种“细胞工厂”中,已被认定为安全菌株的枯草芽孢杆菌可能更具应用前景。在接下来的研究,应将重点放在如何提高产量以期达到大规模量产的水平。

[参考文献]

[1]DengMD,SeversonDK,GrundAD,etal.MetabolicengineeringofEscherichiacoliforindus

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