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琼脂糖凝胶电泳实验

一、实验原理：

琼脂糖凝胶电泳是分离和纯化DNA片段的常用技术。把DNA样

品加入到一块包含电解质的多孔支持介质（琼脂糖凝胶）的样品孔中，

并置于静电场上。由于DNA分子的双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷

酸根残基，因此在电场中向正极移动。在一定的电场强度下，DNA分

子的迁移速度取决于分子筛效应。具有不同的相对分子质量的DNA片

段泳动速度不一样，因而可依据DNA分子的大小来使其分离。凝胶电

泳不仅可分离不同分子质量的DNA，也可以分离相对分子质量相同，

而构型不同的DNA分子。在电泳过程中可以通过示踪染料或相对分子

质量标准参照物和样品一起进行电泳而得到检测。相对分子质量标准

参照物相对可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。在凝胶中加

入少量溴化乙锭(ethidiumbromide,EB)或者ＥＢ类似物，其分子可

插入DNA的碱基之间，形成一种络合物，在254～365nm波长紫外

光照射下，呈桔红色荧光，因此也可对分离的DNA进行检测。

一般琼脂糖凝胶电泳适用于大小在0.2kb～50kb范围内的DNA

片段。三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为：超螺旋

DNA线性DNA开环DNA

正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之

间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段

分析。低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。

注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺

失现象。

适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有

着更好的缓冲能力。电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。

注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下

降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

Marker的选择DNA电泳一定要使用DNAMarker或已知大小的

正对照DNA来估计DNA片段大小。Marker应该选择在目标片段大

小附近ladder较密的，这样对目标片段大小的估计才比较准确。

二、设备：

移液器，微波炉，电泳仪电源，水平式凝胶电泳槽，样品梳，电

子秤，锥形瓶，凝胶成像系统，烧杯，量筒

三、耗材：

PCR产物，质粒，枪头

四、试剂：

1.150×TAE缓冲液：取242gTris碱于1L烧杯中，加入57.1ml的

冰醋酸，100ml的0.5mol/LEDTA（pH8.0），加入去离子水定容到

1L。取2ml50×TAE缓冲液加入98ml去离子水配成100ml1×TAE稀

释缓冲液备用。

2.21.5%琼脂糖

3.3DNA相对分子质量标准样品：DL2000。

4.4Goldview溶液：一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，

3μl/100ml胶。

5.56×上样缓冲液：商品化产品，贮存于4℃。

五、实验步骤：

1．制备胶液：锥形瓶中的0.75g琼脂糖与50ml1×TAE稀释缓冲

液混匀后放入微波炉里加热至琼脂糖完全融化，取出摇匀。

2．制备胶板：将胶槽置于水平支持物上，插入样品梳，注意梳子

齿下缘应与胶槽底面保持1mm左右的间隙；琼脂糖溶液中加入1.5μl

Goldview溶液使其终浓度为3μl/100ml胶；将琼脂糖小心倒入胶槽

内，使胶液形成均匀的胶层。待胶