水飞蓟护肝胶囊增强免疫及对小鼠酒精性肝损伤的保护作用.docx

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水飞蓟护肝胶囊增强免疫及对小鼠酒精性肝损伤的保护作用

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摘要:研究水飞蓟护肝胶囊增强免疫及对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。结果显示高剂量组碳廓清吞噬指数(a)、中、高剂量组小鼠巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬指数及小鼠NK细胞活性明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01或P<0.05)。酒精性肝损伤模型建立成功,试验后与模型对照组(0g/kg·BW)比较,各剂量组肝组织中丙二醛含量均显著降低(P0.05,P0.01),中、高剂量组肝组织中GSH含量显著升高(P0.05)。高剂量组肝组织中TG含量、肝组织中脂肪变性平均分显著降低(P0.05)。表明水飞蓟护肝胶囊有明显的增强免疫力作用,同时具有对化学性肝损伤有辅助保护作用。

关键词:水飞蓟,灵芝,化学性肝损伤,免疫

肝脏免疫系统包含了众多的固有天然免疫细胞,如巨噬细胞、NK细胞和NKT细胞。这些细胞群体大量聚集在肝脏中,表明它们在肝脏生物学中具有重要的地位,能够为机体提供抵抗外来抗原入侵的免疫监视及保护作用[1]。水飞蓟护肝胶囊为水飞蓟提取物、葛根提取物、灵芝提取物、五味子提取物配伍使用,遵循中医理论,本文研究了其增强免疫及对小鼠酒精性肝损伤的保护作用。

1仪器与试药

紫外可见分光光度计(XTL-2400);冰冻切片机(LEICACM510)、病理显微镜(DM4000B)、电子分析天平、半自动生化分析仪、酶标仪、二氧化碳培养箱、显微镜等。全自动生化分析仪(TBA-120FR)等。ICR健康雄性小鼠,体重18~22g。水飞蓟护肝胶囊(自制,0.4g/粒,2.4g/日,葛根提取物:五味子提取物:灵芝提取物:水飞蓟提取物:辅料按照一定比例2:1:1:0.66:11.34混合后装胶囊制成)

2方法

2.1剂量设计

免疫试验分别为溶剂对照组、低、中、高剂量组,低、中、高剂量组,每组10只,按照人体推荐剂量的5,10,30倍设计,分别为0.2、0.4、1.2g/(kg·BW),动物灌胃按0.2ml/(10g·BW)体积给予,对照组给予等体积纯水。每天灌胃1次,连续灌胃30d,进行各项指标的测定。护肝试验选用酒精性肝损伤模型,随机平均分成5组,3个剂量组0.2、0.4、1.2g/(kg·BW),同时设空白对照组(0g/kg·BW)和模型对照组(0g/kg·BW),小鼠灌胃体积为10mL/kg·BW。每组10只,用无菌水代替受试物,每日灌胃体积与各受试物组相同。连续灌胃30d。

2.2方法

2.2.1小鼠碳廓清实验末次给予受检样品后第2天,小鼠尾静脉注射以生理盐水4倍稀释的印度墨汁,每10g体重注射0.1mL,墨汁注射后立即计时。于注射墨汁后2、10min,分别从内眦静脉丛取血30μL,加入到3mL0.1%Na2CO3溶液中,摇匀。以0.1%Na2CO3作空白对照,用723分光光度计在600nm波长处,比色测光密度值(OD)。将小鼠处死,取肝、脾称重,计算吞噬指数a。

2.2.2小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验末次给予受检样品后第2天,小鼠腹腔注射20%(v/v,用生理盐水配制)鸡红细胞(2000r/min,离心10min)悬液1mL,间隔30min,颈椎脱臼处死,仰位固定于鼠板上,正中切开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2mL,转动鼠板1min。取腹腔巨噬细胞洗液1mL,平均分滴在2张载玻片上,放入垫有湿纱布的搪瓷盒内,置37℃孵箱温育30min。孵毕,于生理盐水中漂洗以去除未贴片细胞。晾干,以甲醇∶丙酮(1∶1)固定,4%(v/v)Giemsa-磷酸盐缓冲液染色。用纯水漂洗晾干。油镜下每片计数100个巨噬细胞,按下式计算吞噬率和吞噬指数:吞噬率%=(吞噬鸡红细胞的巨噬细胞数/计数的巨噬细胞数)×100;吞噬指数=被吞噬的鸡红细胞总数/计数的巨噬细胞数。

2.2.3NK细胞活性测定实验末次给予受检样品后第2天,将小鼠颈椎脱臼

处死,无菌取脾,用注射器吸取少量Hank’s液轻轻吹出脾细胞,制成单个细胞悬液。用无菌Hank’s液洗2次,每次离心10min(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1640完全培养液中,台盼蓝染色计数活细胞数(应在95%以上),调细胞浓度为2×107个/mL。此细胞为效应细胞。试验前24h将YAC-1细胞进行传代培养,用前以Hank’s液洗3次,用1640完全培养液调细胞浓度为4×105个/mL,此细胞为靶细胞。取靶细胞和效应细胞各100μL,加入U形96孔培养板中:靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL,靶细胞最大释放孔加靶细胞和2.5%Triton液各100μL。上述各项均设三个平行孔,5%CO2,3

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