蛋白质和氨基酸的测定.ppt

注：测蛋白质时叫双缩脲法，并不另加双缩脲。样品不用消化

可直接用粉样，振荡、显色后离心。

2. 方法特点及应用范围本法灵敏度较低，但操作简单快速，故在生物化学领域中常用。本法亦适用于豆类、油料、米谷等作物种子及肉类等样品测定。3.主要仪器：分光光度计，离心机4.试剂：(1)碱性硫酸铜溶液(2)四氯化碳第32页,共51页，星期六，2024年，5月5．操作方法：采用凯氏法测出的蛋白质样品为标准样绘标准曲线。三．紫外吸收法1．原理：利用蛋白质的特有基团，│R（—NH—CH—CO）对紫外光有吸收作用，在280nm下，吸光度与蛋白质浓度成直线关系，求含量。第33页,共51页，星期六，2024年，5月2．适用范围：常用于生物化学工作，因为干扰因素多，故在食品分析领域应用不广泛。3．主要仪器：①紫外分光光度计②离心机（3000～5000r/min）4．操作：用凯氏法测得结果的同类样品作标样做标准曲线。测牛乳冰醋酸第34页,共51页，星期六，2024年，5月第五节氨基酸的定性测定（自学）利用各种显色反应（134～138页）第35页,共51页，星期六，2024年，5月一、氨基酸的一般显色反应茚三酮法、吲哚醌法和邻苯二甲醛法。前二种是经典的常用显色法，后一种是近年来发展起来的荧光显色法。1.茚三酮法氨基酸或蛋白质能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物。2.吲哚醌法各种氨基酸与吲哚醌试剂能显示不同颜色，因此可借此辩认氨基酸。3.邻苯二甲醛法（最灵敏）邻苯二甲醛在2-巯基乙醇存在下，在碱性溶液中与氨基酸作用产生荧光化合物，最适的激发光和发射光波长分别为340nm和455nm。在手提式紫外灯(254/365)下观察。各种氨基酸显现的荧光强度不同。第36页,共51页，星期六，2024年，5月二、个别氨基酸的显色反应利用个别氨基酸与某些试剂具有特殊的显色反应定性氨基酸。可应用于纸层析和纸电泳显色。精氨酸，胱氨酸、半胱氨酸、甘氨酸、脯氨酸、丝氨酸和羟赖氨酸、羟脯氨酸,色氨酸、酪氨酸、酪氨酸和组氨酸。第37页,共51页，星期六，2024年，5月第六节氨基酸定量测定

一．氨基酸的一般定量测定

（一）甲醛滴定法

1.原理：氨基酸本身有碱性—NH2—基，又有酸性—COOH基，成中性内盐，加入甲醛溶液后，与—NH2—结合，碱性消失，再用强碱来滴定—COOH基。（有多种写法）第38页,共51页，星期六，2024年，5月2、测定适量样品于100ml容量瓶中（含氨基酸约20mg）→水定容→取20.0ml于烧杯中，加60ml水→用0.05mol/LNaOH滴至pH8.2（此体积可供计算总酸含量）→加10.0ml中性甲醛→NaOH滴至pH9.2，记录消耗体积V1。空白试验：80ml水→NaOH调至pH8.2→加10.0ml中性甲醛→NaOH滴至pH9.2，耗V0ml。用酸度计电极的选择？第39页,共51页，星期六，2024年，5月3、说明①本法准确快速，可用于各类样品游离氨基酸含量测定。②固样先粉碎，称量后用水萃取约半小时（50℃水浴）。③铵盐的存在使结果偏高，因其也与甲醛作用产生酸。④也可用指示剂指示终点（中性红、百里酚酞），但准确度稍差，对深色样品要用活性炭脱色，但芳香族氨基酸易被吸附。第40页,共51页，星期六，2024年，5月同时取两份样：①+中性红指示剂，用氢氧化钠直接滴，中和样液中其它酸性物质。pH6.8～8.0②+百里酚酞+中性甲醛+NaOH滴，中和了样液中氨基酸的羧基与其它酸性物质的总和。pH9.4～10.6(淡蓝色)二者之差可计算氨基酸含量。第41页,共51页，星期六，2024年，5月（二）茚三酮比色法1、原理：氨基酸在碱性溶液中能与茚三酮作用，生成蓝紫色化合物（脯氨酸反应成黄色），可用吸光光度法测定，λ=570nm。2、测定：样品→水提取氨基酸，活性炭脱色（Δ），过滤→分取澄清液于25ml比色管中→加茚三酮，pH8.04磷酸盐缓冲液→水浴加热15min→迅速冷却，水定容→静置15min→测A570，空白为参比。同时作标准曲线，氨基酸标液用某一干燥的氨基酸如异亮氨酸配制。3、结果：氨基酸含量（mg/100g）以所用标准氨基酸计第42页,共51页，星期六，2024年，5月二．个别氨基酸的定量测定介绍了8种氨基酸的定量