植物DNA、RNA及蛋白的提取与分析课件.pptxVIP

植物DNA、RNA及蛋白

的提取与分析;;DNA提取原则;植物DNA提取的方法;DNA提取的基本步骤;CTAB法流程;CTAB提取液主要成分;;注意事项;DNA的质量检测;;分离RNA的目的;RNA提取的关键--防止RNase降解RNA;1.耐高温的器具（如玻璃制品、研钵、剪刀、镊子等）于180℃下干烤8h

2.塑料耗材（Tip、EP管等）用0.1%的DEPC水浸泡过夜，然后高压，再烤干备用

3.实验用的氯仿、乙醇为RNA专用，水为DEPC处理水

4.使用有效的RNase抑制剂：如异硫氢酸胍、RNasin

5.配制的溶液应尽可能的用0.1%DEPC，在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂，应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制

6.实验过程需带一次性塑料手套且经常更换

7.设置RNA操作专用实验室，所有器械等应为专用。

;常用的RNase抑制剂;1.胍盐法：用异硫氰酸胍或盐酸胍和?-巯基乙醇变性蛋白，并抑制RNase的活性，经酚氯仿抽提后再沉淀。

2.氯化锂沉淀法：因为锂在在一定pH下能使RNA相对特异地沉淀，但容易使小分子RNA损失，而且残留的锂离子对mRNA有抑制作用。

3.苯酚法：用SDS变性蛋白并抑制RNase活性，经多次酚/氯仿抽提除去蛋白、多糖、色素等后，用NaAC和乙醇沉淀RNA。;TRI?Reagent提取总RNA;TRI?Reagent提取步骤;注意事项;电泳试验

吸光度测定

保温试验;电泳试验

吸光度测定

保温试验;电泳试验

吸光度测定

保温试验;;蛋白的制备;蛋白提取方法;1、pH值

蛋白质，酶是具有等电点的两性电解质，提取液的pH值应选择在偏离等电点两侧的pH范围内。用稀酸或稀碱提取时，应防止过酸或过碱而引起蛋白质可解离基团发生变化，从而导致蛋白质构象的不可逆变化，一般来说，碱性蛋白质用偏酸性的提取液提取，而酸性蛋白质用偏碱性的提取液。

2、盐浓度

稀浓度可促进蛋白质的溶，称为盐溶作用。同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔。升浓度为宜。缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。;（二）有机溶剂提取法

一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐???液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。但必须在低温下操作。丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。;我们实验室的方法;总蛋白的测定;;;一、DNA样品不纯;二、DNA降解;1.实验材料不佳或量少

2.破壁或裂解不充分

3.沉淀不完全

4.洗涤时DNA丢失;四、RNA易降解;五、RNA样品不纯;六、RNA得率低;七、RNA电泳检测不到条带