integrinα1-p38信号通路在IL-6及周期性机械应力作用下髓核.docx

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integrinα1/p38信号通路在IL-6及周期性机械应力作用下髓核

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江阴市第三人民医院骨科，江苏江阴，214400

【摘要】目的：研究integrinα1/p38信号通路在IL-6及周期性机械应力作用下髓核细胞（NPC）生物学效用调控中的作用。方法：30只清洁级SD大鼠（180～200g），雌性。无菌条件下完成椎间盘原代NPC细胞的制备及传代培养。取第三代对数生长期的NPC细胞进行实验，给予周期性机械应力并加入IL-6浓度为100μg/L，同时根据分组分别加入10%含血清培养基（对照组）、integrinα1功能阻断性抗体（integrinα1抑制剂组）、10μMSB203580（p38抑制剂组）进行处理24h。评测NPC细胞生物学效用及基因表达情况。结果：①MTT法测定OD值以及Proteoglycan、Collagen-II基因表达，这三项指标integrinα1抑制剂组、p38抑制剂组均显著高于对照组（P0.05）。②随着时间的推移，integrinα1抑制剂组、p38抑制剂组细胞迁移较对照组明显。③integrinα1、p-p38的基因表达：这两项指标integrinα1抑制剂组均显著低于对照组（P0.05）；p38抑制剂组仅p-p38的基因表达低于对照组（P0.05），而integrinα1的基因表达与对照组无明显差异（P0.05）。结论：integrinα1/p38信号通路为IL-6及周期性机械应力作用下NPC细胞新陈代谢的重要途径。

【关键字】髓核细胞；IL-6；integrinα1；p38信号通路

目前，已有研究证实各类腰背痛疾病以椎间盘退变为主因，而信号通路在椎间盘退变过程中存在重要意义。机体细胞因信号传导需要而存在的诸多通路，往往通过多个共同靶点架构成为复杂的信号网络。其中，p38信号通路对于椎间盘退变尤为重要，甚至一定程度上起到了决定性作用[1]。前期研究已证实，IL-6能够显著抑制周期性机械应力下髓核细胞（NPC）增殖、迁移和细胞外基质合成，同时促进integrinα1的基因表达及p38磷酸化。然而并未阐明integrinα1与p38之间的相互关系，以及需要进一步证实p38信号通路对于NPC细胞生物学效用的重要意义。

材料与方法

实验动物

30只清洁级SD大鼠（180～200g），雌性，由南京东极生物科技有限公司提供，并用于椎间盘原代髓核细胞的制备。

实验药物、主要试剂与仪器

DMEM/F12（Hyclone）、胎牛血清（Hyclone）、PBS（南京生兴生物）、IL-6试剂盒（罗氏公司，瑞士）、PCR仪（AppliedBiosystems）、血球计数板（上海求精生化）、CO2细胞培养箱（Thermofisher）、细胞拉力施加系统（FlexcellInternational）等。

髓核细胞分离与培养

无菌条件下分离SD大鼠椎间盘中的髓核，置于含1%青-链霉素的DMEM/F12培养液中，剪成小块（1*1*1mm）后予0.1%Ⅱ型胶原酶水浴消化（3h），通过无菌过滤网（200目）过滤后获得细胞悬液，1000rpm离心5min。倒掉上清后，加入3ml培养基重悬细胞，1:3传代至培养皿中培养。培养箱条件设定5%CO2、37℃。传代培养至第三代时，采用对数生长期的NPC细胞进行本实验。

观察项目与方法

NPC细胞以2×105/mL密度接种于96孔板中，每孔100μL。待细胞贴壁，更换无血清培养基（24h），然后同时再次更换为10%含血清培养基。向NPC细胞施加周期性机械压力，10％拉伸程度、10次/分钟，每次拉伸期及松弛期各2s。加入IL-6浓度为100μg/L，同时根据分组分别加入10%含血清培养基（对照组）、integrinα1功能阻断性抗体并采用shRNA技术（integrinα1抑制剂组）、10μMSB203580（p38抑制剂组）进行处理24h。指标评价：（1）生物学效用：通过MTT法测定NPC细胞增殖情况。通过划痕实验观察NPC细胞迁移情况。运用Real-timePCR试剂盒测定NPC细胞外基质中蛋白聚糖（Proteoglycan）、Ⅱ型胶原（Collagen-II）的合成情况。（2）运用Real-timePCR试剂盒测定integrinα1、p-p38（磷酸化的p38）的基因表达情况。每项指标取24个复孔。

统计学处理

由SPSS23.0软件进行统计学分析，采用多组间比较的单因素方差分析或两组间比较的q检验。其中，采用观察法对划痕实验进行描述。显著性差异α=0.05，即P0.05为差异具有统计学意义。

结果

MTT法测定OD值以及Proteogly