《第08讲 基因工程的基本操作程序》预习讲义.docxVIP

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第08讲基因工程的基本操作程序

【学习目标】

【基础知识】

一、目的基因的筛选和获取

1.筛选合适的目的基因：从相关的已知结构和功能清晰的基因中进行筛选是较为有效的方法之一，如Bt基因是培育转基因抗虫棉较为合适的目的基因。

2.利用PCR获取和扩增目的基因

（1）获取目的基因的方法a.人工合成（基因碱基序列是已知的）

b.PCR技术扩增（已知基因两侧的碱基序列）

c.从基因文库中获取（原核生物）

（2）PCR技术

PCR的含义：是聚合酶链式反应的缩写，它是一项根据DNA半保留复制的原理在体外提供参与DNA复制的各种组分与反应条件，对目的基因的核苷酸序列进行大量复制的技术。

基本条件场所：需要在一定的缓冲溶液中进行，其中一般要添加Mg2+

模板：已知两侧碱基序列的DNA母链

原料：4种脱氧核苷酸

酶：耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）

引物：是2种与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸

反应过程变性：加热超过90℃，双链DNA解旋为单链

复性：温度下降至50℃左右，两种引物与互补单链DNA结合

延伸：温度上升到72℃左右，四种脱氧核苷酸在耐高温的DNA聚合酶作用下合成子链DNA

结果：两引物间固定长度的DNA序列呈指数扩增（即2n）

鉴定PCR产物：用琼脂糖凝胶电泳来鉴定

注：1.含脱氧核苷酸链等长的DNA分子数为2n-2n

2.第三轮出现两条链等长的DNA片段

3.两种引物之间需要满足的是：不能碱基互补配对，是防止引物之间结合形成双链，降低引物与DNA模板链结合的效率。

归纳总结

苏云金杆菌伴胞晶体蛋白（Bt抗虫蛋白）为什么对人畜无害的原因：

Bt抗虫蛋白只有在某类昆虫肠道的碱性环境中才能表现出毒性，而人和牲畜的胃液呈酸性，肠道细胞也没有特异性受体，不能穿透细胞膜杀死细胞。

基因文库的概念：将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同基因，成为基因文库。

cDNA概念：以mRNA为模板进行逆转录形成的DNA

6、cDNA文库和基因组文库的比较：

文库类型

cDNA文库

基因组文库

文库大小

小

大

基因中启动子

无

有

基因中内含子

无

有

基因多少

某种基因的部分基因

某种生物的全部基因

7、获取目的基因的三种方法：①人工合成获取；②从基因文库获取；③通过PCR技术获取

8、PCR技术：聚合酶链式反应的缩写，是一项根据DNA半保留复制的原理，在体外提供参与DNA复制的各种组分和反应条件，对目的基因的核苷酸进行大量复制的技术。

9、引物是一小段能与DNA母链的一段碱基序列互补配对的短单链核酸。①体内复制的引物为RNA单链；②体外复制的引物一般为DNA单链

10、PCR反应的条件：需要在一定的缓冲溶液中进行，需提供模板、引物、脱氧核苷酸、耐高温的DNA聚合酶（Taq酶）；同时需要控制温度

11、运用PCR技术时，缓冲液中需要加入一定的Mg2+，激活DNA聚合酶

10、DNA体内复制的条件：

11、DNA体外复制（PCR）的条件

PCR扩增的过程：

名称

具体内容

变性

目的基因DNA受热变性后形成单链

复性（退火）

引物与单链相应互补序列结合

延伸

以单链DNA为模板，在DNA聚合酶将溶液中四种脱氧核苷酸根据碱基互补配对原则合成新的子链

PCR扩增的结果：每次循环后目的基因的量增加一倍，计算公式：2n，其中n为扩增循环的次数

扩增循环n次所需要的引物：计算公式：2n+1-2，至少需要经过3次扩增以后才能得到目的基因，且扩增第3次后能得到2个目的基因

PCR产物鉴定方法：采用琼脂糖凝胶电泳来鉴定PCR的产物

二、基因表达载体的构建

1.构建基因表达载体的目的a.让目的基因在受体细胞中稳定存在，并遗传给下一代

b.使目的基因能够表达和发挥作用

2.基因表达载体的构成：目的基因+标记基因+启动子+终止子

启动子：位于DNA上.在基因的上游，是RNA聚合酶识别和结合的部位，

躯动基因转录出mRNA，有时为了满足应用需要，会在载体中人工构建诱导型启动子，当诱导物存在时，可以激活或抑制目的基因的表达。

终止子：也位于DNA上在基因的下游，终止转录

起始密码子和终止密码子：位于mRNA上，决定翻译的开始和结束

3.基因表达载体的构建过程（P80-图3-6）

（1）首先用一定的限制酶切割载体

（2）然后用同种限制酶或能产生相同末端的限制酶

切割含目的基因的DNA片段

再利用DNA连接酶将含目的基因的DNA片段

拼接到载体的切口处

注意：选择限制酶的三大原则一大要求（题干特定要求）

不能破坏目的基因如图甲，