乳腺癌患者血浆miRNA-503表达水平研究.docx

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乳腺癌患者血浆miRNA-503表达水平研究

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龙香娥孙静周立郑霓亚唐鲁兵

【摘要】目的：探讨乳腺癌患者血浆中miR-503的表达水平。方法：采用实时定量RT-PCR方法检测20例乳腺癌患者及15例健康志愿者血浆中miR-503的表达水平。结果：乳腺癌患者血浆miR-503表达显著低于正常对照组，两者差异有统计学意义（P=0.001）。结论：血浆miR-503在乳腺癌中的表达水平低于正常人，对于乳腺癌的诊断具有一定价值。

【关键词】乳腺癌;miR-503;血浆

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一，我国女性乳腺癌的发病率与死亡率正逐年增加，严重威胁着妇女的健康。早期诊断和早期治疗是防治乳腺癌和降低死亡率的最有效的办法。

目前应用于临床诊断乳腺癌的肿瘤标志物主要有癌胚抗原（CEA）和糖类抗原153（CA153）等，但这些肿瘤标志物在乳腺癌的早期中效能较差[1]，难以满足早期诊断的需求。微小RNA（microRNA，miRNA）是一类长度约18-25bp的内源性非编码小分子RNA。研究发现在乳腺癌与正常人中存在着差异表达的miRNA，这些差异表达的miRNA在乳腺癌的早期诊断中有较高效能[1]。miR-503为miRNA家族中的一员，不少研究报道miR-503在不同细胞及组织中的差异表达。本研究的主要目的是通过应用实时定量RT-PCR检测乳腺癌患者血浆与正常人群血浆中miR-503的表达水平，分析miRNA-503在乳腺癌患者血浆中的表达水平与正常人的差异，为miR-503有希望作为乳腺癌辅助诊断的分子标志物提供实验依据。

1材料与方法

1.1研究对象

选择宁波市妇女儿童医院乳腺癌住院患者20例（女性，年龄51.18±5.37岁）和15例健康体检者（女性，年龄50.13±4.77岁）作为研究对象（两组研究对象年龄差异无统计学意义（P0.05）。所有患者均经宁波市临床病理诊断中心确诊。收集各研究对象的外周静脉血3ml至EDTA抗凝试管，3000转/分离心10分钟，取上层血浆于1.5mlEP管。所有血浆标本放于-20°C冰箱冻存待測。

1.2主要试剂及仪器

RNA提取试剂为美国Ambion产品TrizolLSreagent;逆转录试剂盒、实时荧光定量PCR试剂盒、U6及miR-300特异RT及PCR引物均购于宝生物工程有限公司（大连TAKARA公司）。实时定量PCR仪为美国Stratagene的MX3005PPCR自动系列化分析仪。

1.3方法

1.3.1血浆总RNA提取及含量测定

使用抽提RNA试剂TrizolLSreagent抽提各样本血浆总RNA，具体操作按照说明书进行。抽提的RNA溶解于10μlDEPC水中。使用分光光度计测定提取的RNA样品260nm和280nm的吸收值，分析RNA的纯度。OD260/OD280在1.8～2.0时RNA纯度较高。计算提取的RNA含量。

1.3.2逆转录反应及实时荧光定量PCR检测miRNA-503的水平

使用逆转录试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，按厂家说明书进行操作。以逆转录的cDNA为模板，用荧光定量PCR技术检测miRNA-503的表达水平。每一样品设3个复孔，取其平均值，以U6为内参，分别扩增miRNA和U6小RNA，用Mx5035PQPCRSystem进行反应。Ct值为扩增产物达到临界阈值时所对应的循环数。ΔCt=CtmiRNA-CtU6;ΔΔCt=ΔCt实验组-ΔCt对照组。以2-△Ct表示miR-503的相对表达水平，最后以2-△△Ct表示实验组miR-503的表达水平相对于对照组的差异倍数。

1.3.3统计分析

数据采用SPSS22.0统计软件分析，数据用平均数±标准差（mean±SD）表示，样本均数比较采用独立样本t检验，实验至少重复3次，P0.05认为有统计学意义。

2结果

统计20例乳腺癌患者2-△Ct结果显示，20例乳腺癌患者血浆中miR-503的相对表达水平为0.075±0.05，同样方法得出对照组血浆中miR-503的相对表达水平为0.272±0.12，与正常人相比，乳腺癌患者血浆中miR-503的表达水平明显下调，差异有统计学意义（P=0.001）。通过2-△△Ct得出20例乳腺癌患者血浆中miR-503的表达水平相对于对照组的0.244，即对照组的miR-503的表达水平为实验组的4.10倍。若以对照组血浆中miR-503的相对表达水平的均数0.272为正常人血浆miR-503的标准表达水平，20例乳腺癌中有19例乳腺癌患者血浆中的miR-503表达水平不到正常人的1/2。具体结果见图1。

3讨论

miRNA是人体内广泛存在的非编码小分子RNA，与人类肿瘤