检验-流式细胞分析仪器与技术【64页】.pptxVIP

;主要内容;流式细胞术（flowcytometry，FCM）是以流式细胞仪作为检测工具，结合激光技术、计算机分析技术、流体力学、细胞荧光染色技术和免疫学技术等学科的理论与技术，对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒同时进行多参数、快速定量分析和分选的高新技术

研究对象为生物颗粒，如各种细胞、微生物及人工合成微球等;4;激光;细胞分选原理;第二节流式细胞仪基本结构;流动室和液流驱动系统

;流动室——仪器的核心部件，待测样品与激光在这里相交，通常由有机玻璃、光学玻璃或石英等制成。

流动室内充满了鞘液，使细胞排成单列进入流动室喷嘴口，形成细胞液柱。;FCM的液流系统

（如何形成单个细胞流）;液流驱动系统：包括压缩空气泵、压力传感器、鞘液过滤器和样本压力调节器等。

常用的液流系统中细胞流和鞘液流的驱动一般采用正压的方法控制的，保证了鞘液的流速恒定。

鞘液以匀速通过流动室，因此整个液流系统运行流速是不变的。;包括光学激发系统和光学收集系统。

流式细胞仪的测定是基于对光信号的检测来实现的，因此光学系统是流式细胞仪中最为重要的一个系统。;;光学激发系统;前向角散射光（FSC）;侧向角散射光（SSC）;;;光学收集系统：主要由多组透镜、滤光片和分光镜等光学元件组成，将不同波长的光信号送入不同的探测器;;组成：光电转换器、放大器和信号处理电路

作用：将产生的各种光信号成比例的转换成电信号，进行数字化处理后转入电子计算机进行数据采集和分析。;;;分选系统;;;荧光灵敏度

仪器能检测到单个微球上标有荧光分子的最小值

衡量FCM检测荧光信号的重要指标

FSC检测灵敏度

FCM能检测到最小颗粒大小;;;分析速度以每秒分析的细胞个数来表示。;细胞分选对仪器的性能要求较高

分选是流式细胞仪的重要功能之一

分选功能的装置较为复杂;每秒可分离所要细胞的个数，一般要求分选速度为10000个/秒左右。;;能否制备出合格的单细胞悬液是关系最终分析结果准确与否的关键。

单细胞悬液大多来自生物样品，不同组织来源的样本制备方法也不同。;

新鲜的外周血是天然的单细胞悬液。

单次密度梯度离心法是最常用于分离制备单个核细胞悬液，采用淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞。;（二）培养细胞的单细胞悬液制备;将新鲜实体组织进行单细胞悬液的制备是一项困难而复杂的技术。理想的状态是既要达到分离细胞的目的又要不损伤细胞。

最常用的方法是酶消化法、机械法、化学处理法和表面活性剂处理法等。

不论是哪种方法都不可避免的会对细胞表面膜结构、细胞活性和功能等造成不同程度的损伤。;该制备方法的建立扩大了流式细胞术的应用范围，有利于进行临床回顾性研究和利用。

常用的方法有二甲苯脱蜡法、组织清洁剂脱蜡法和甲氧-双氧水处理法。

对石蜡切片的要求较严格。;活检标本及各种内镜取材标本可制备成单细胞悬液。

一般要求镜检取材标本至少取3块以上。

制备方法与新鲜实体组织基本相同。;脱落细胞应去除取材伴随的杂质后，再制备单细胞悬液。

脱落细胞用流式细胞术检测，是一种更为客观的检测手段，对临床诊断和治疗很有意义。;FCM主要的信号参数包括散射光信号和荧光信号，荧光染色是保证荧光信号产生的关键步骤。

直接免疫荧光染色以双色以上分析较为常用。

以FITC和PE组合多见

单色免疫荧光多用于单克隆抗体特异性较高、单一细胞群的抗原检测。;直接免疫荧光染色法是荧光抗体技术最基本、最简单的方法，多用于细胞表面标志的染色分析。;多色流式细胞仪的开发促进了新的荧光染料的合成及抗体标记物的发展。

多色标记简便、省时、节约成本，但对操作人员的要求较高。

试剂的选择还需结合仪器的配置考虑。;自发荧光：未经荧光标记的细胞受到激光照射后所发出的荧光。

每种细胞群都有不同水平的自发荧光，如淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等。

自发荧光易引起信号干扰，出现假阳性结果，在实际临床检验工作中应注意区别。

;（四）FCM常见荧光染料的种类和特性;常用的染料有以下几种：;一）阴性对照

确定非特异性荧光

二）阳性对照

查看抗体的有效性;一）仪器的校准

光路和流路的校准采用荧光微球flow-check计算CV值

PMT校准采用荧光微球flow-set校准

二）补偿调节

三）阈值设定

采用FSC指标来设定

四）上样速度;核心技术包括xMAP技术和xTAG技术，新一代诊断技术平台

技术特点：高通量、高速度、重复性好、线性范围宽、敏感性高、检测物质广泛、低样本量、检测物质