不对称PCR的引物浓度优化及在柑橘基因型分析上的应用.docx

?

?

不对称PCR的引物浓度优化及在柑橘基因型分析上的应用

?

?

魏召新+朱世平+阳佳位

摘要：对柑橘不对称PCR的引物比例浓度进行优化筛选，并以不同柑橘品种的基因组片段为模板验证不对称PCR在柑橘品种基因型分析中的可行性。结果表明，不对称PCR双侧的引物最佳浓度因引物不同而不同，当浓度为10∶1时均能达到理想效果，可见不对称PCR可以用于柑橘基因型分析。

关键词：不对称PCR；单链构象多态性；柑橘；引物浓度比；基因型分析

：S666.201文献标志码：A

：1002-1302（2016）11-0046-02

不对称PCR利用不等量的一对引物进行PCR扩增，产生单链产物（ssDNA），这对引物分别称为非限制性引物与限制性引物。在PCR反应的最初10～15个循环中，其扩增产物主要是双链DNA（dsDNA），但当限制性引物消耗完后，非限制性引物引导的PCR就会产生大量的单链产物。不对称PCR作为一个基础试验技术，方法简单、成本低廉、用途广泛，用于制备单链模板以用于双脱氧测序[1]，用于cDNA扩增以研究真核生物的DNA外显子[2]，用于单链探针制备[3]，还可与酶联免疫法结合检测柑橘CTV病毒[4]，甚至结合毛细管电泳技术对人进行疾病诊断[5]。

不对称PCR制备ssDNA须多次摸索优化2条引物的比例。常规不对称PCR是利用单侧引物进行一次PCR，然后进行电泳检测，这种方法要消耗大量的DNA模板。而二次PCR是先用等浓度的引物PCR扩增制备dsDNA，然后以此dsDNA为模板，再以其中的一条引物进行第2次PCR，制备ssDNA，大大减少模板的消耗量，产生的dsDNA与ssDNA由于分子量不同可以在电泳中分开，并可利用单链构象多态性鉴别不同样品之间的差异。

利用不对称PCR进行基因差异分析，不仅具有PCR-SSCP研究单核苷酸多态性（SNP）的功能，而且简化了操作步骤，提高了工作效率。柑橘资源丰富、品种繁多、种属间易于杂交、芽变材料多、基因组大（约367Mbp）[6]，随着甜橙[7]和单倍体克里曼丁橘[8]成功测序推动，SNP研究必將得到进一步拓展和深化，尽管有利用不对称PCR对基因突变效率进行检测的报道[9]，但利用SNP应用于柑橘基因研究方面还比较少，因此本试验对不对称PCR体系中上下游引物浓度比进行优化，并以柑橘为材料进行基因型研究的可行性。

1材料与方法

根据柑橘的基因序列设计3对引物，产物片段长度在100～300bp。采用二次PCR方式，均采用25μL体系，ddH2O18.35μL，10×Buffer2.5μL，dNTPs（25mmol/L）1.0μL，MgCl21μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，rTaq0.15μL，模板1.0μL。引物M1源于UnigenCit.47.1，上游引物为5′-CCGAGAAAACGCAAAAGCTA-3′，下游引物为5′-TTGTACTCGAGCAGCGACAC-3′。引物M2源于UnigenCit.107.1，上游引物为5′-CCCTGAGACGAAGAACAAGG-3′，下游引物为5′-CTGGCAAGCAACTGGAAGAC-3′。引物M3源于UnigenCit.10080.1，上游引物为5′-ACCATGACCGCTGAGGAATA-3′，下游引物为5′-GGAAAACAGGGCAACTTCAG-3′。其中，第2次PCR引物对在一侧引物保持原浓度的条件下，另一侧引物按比例稀释，模板以第1次PCR产物稀释100～200倍后，各组分均按第1次PCR体系体积加入反应体系。

PCR反应条件沿用前期优化过的PCR反应条件：95℃预变性5min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸30s，33个循环；最后72℃延伸10min。取3μL扩增产物，加6μL98%去离子甲酰胺，10mmol/LEDTA（pH值8.0），0.25%二甲苯青，0.25%溴酚蓝变性剂混匀，上样于10%聚丙烯酰胺凝胶（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE），10℃110V条件下电泳5h，银染显色。

2结果与分析

2.1不对称PCR引物浓度比优化

以特洛维塔甜橙的DNA为模板，采用M1和M2引物对进行引物不同浓度的不对称PCR比较，电泳结果见图1和图2。图1和图2中各对应的泳道其产物PCR条件和电泳条件均相同，唯一不同的是引物，电泳后的效果差异明显，图1中上下游引物从40∶1时产物带开始明显不清晰，但图2中的单双链产物始终存在。

由图1的电泳结果可见，随着单侧引物浓度的降低，双链产物和单链产物也逐渐减少，上下游引物比例在10∶1时，单链产物量