PCR快速检测淋病奈瑟菌NspA基因方法的建立及分析.docxVIP

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PCR快速检测淋病奈瑟菌NspA基因方法的建立及分析

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王彦王琨刘小林刘霞王西珍

【摘要】目的构建PCR检测淋病奈瑟菌NspA基因的方法，为寻找快速检测淋病奈瑟菌的方法提供理论依据。方法根据NspA基因序列设计一对引物，从10例已成功培养出淋病奈瑟菌的患者尿道分泌物中用PCR方法扩增NspA基因，并测序鉴定。结果1.0%琼脂糖凝胶电泳显示成功获得一个约528bp的基因片段，基因测序鉴定与本实验设计相符。结论淋球菌常规培养检测和鉴定需2～3天的时间，而PCR快速检测淋病奈瑟菌NspA基因，只需2～3小时便能获得数据，缩短了检测时间，给临床诊治赢得宝贵时间。

【关键词】PCR;淋病奈瑟菌;NspA基因

R392AISSN.2095.6681.2019.29..02

淋病病原体是淋病奈瑟菌（Neisseriagonorrhoeae，NG）俗称淋球菌，它的唯一天然宿主是人类。淋病奈瑟菌NspA基因是淋球菌表面蛋白A的表达基因，有研究发现NspA抗原不但在细菌表面持续表达，而且高度保守，淋球菌NspA氨基酸序列在淋球菌菌株之间的同源性高达98%。本研究旨在寻找一种快速检测淋球菌的方法，为临床诊治赢得宝贵时间。

1材料与方法

1.1?标本采集

收集自2016年9月～2018年3月我院皮肤性病科、男性科、泌尿外科门诊疑似淋病患者，其中男性取尿道分泌物，女性取距宫颈口1～1.5cm处分泌物，装入无菌试管，-80℃冷冻备用。从中选取10例经VITEK-2COMPACT全自动微生物分析仪鉴定为淋病奈瑟菌的患者分泌物用PCR方法扩增NspA基因。

1.2?方法

1.2.1设计和合成引物

以淋球菌DNA为模板，根据GeneBank报道的NspA（gi核甘酸序列，利用PrimerPremier5.0软件自行设计引物和探针，由invitrogen公司合成。引物如下：

上游引物P1：5′-GCATGAAAAAAGCACTTGCC-3′

下游引物P2：5′-CCGTCAGAATTTGACGCGCAC-3′

用PCR来验证所设计引物的特异性，并使用淋球菌标准菌株CMCC29403作为阳性对照;用可能成为尿道感染致病菌的标准菌株大肠埃希菌ATCC25922，作为阴性对照（由江苏省临检中心提供）。

1.2.2DNA的提取和扩增

1.2.2.1临床样本的DNA提取

把10例临床样本的棉拭子在磷酸盐缓冲液（PBS）中（2mL）挤压洗1～2min，并用Votex漩涡振荡器振荡1min，弃去棉拭子使分泌物尽量溶于生理盐水中，悬浮液放入离心机3000r/min离心5min（离心半径16cm），弃上清液，用1mL无菌生理盐水悬浮细胞，放入离心机，3000r/min离心5min（离心半径16cm），弃上清液，细胞重新溶于1×TE缓冲液中（100μL），100℃加热煮沸10min后放入离心机12000r/min离心10min（离心半径16cm），上清液含DNA模板，用于PCR扩增。

1.2.2.2阳性对照、阴性对照

按照《全国临床检验操作规程》要求，取淋球菌标准菌株CMCC29403增菌后接种于巧克力培养基中培养，用苯酚-氯仿法提取淋球菌基因组DNA，PCR扩增NspA基因，作为阳性对照。以同样方法取标准菌株大肠埃希菌ATCC25922作为阴性对照。

1.2.2.3NspA基因的PCR扩增

取已准备好的10例临床样本DNA，用设计的P1和P2为引物，PCR扩增NspA基因，25μL反应体系如下：10×PCRBuffer2.5μL;10μmol/L上游引物1μl;10μmol/L下游引物1μL;dNTP1.5μL;Taq酶0.5μL;模板DNA1μL;去离子水17.5μL。反应条件为：94℃5min;94℃60S;58℃45S;72℃1min;共35个循环;最后72℃10min。

1.2.2.4NspA基因核苷酸序列鉴定

按PCR胶回收纯化试剂盒说明书纯化PCR产物，将经柱式胶回收纯化临床PCR产物送往INVITROGEN公司进行测序鉴定。

2结果

2.1?PCR扩增NspA基因

采用P1和P2为引物，对已准备好的10例临床样本DNA模板进行PCR扩增，在1.0%琼脂糖凝胶中电泳，得到一条与NspA预期相符大小约为528bp的清晰条带，与本实验设计相符，见图1。

2.2?序列测定

本研究PCR扩增的10例临床NspA基因全长528bp（含起始密码和终止密码），编码175个氨基酸。对测序结果作Blastn分析，结果发现PCR扩增的临床NspA基因序列与GeneBank报道的淋球菌（CMCC29