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(完整)时间分辨荧光免疫分析的原理

一、前言

近百年来,“特效试剂一直是分析化学家追求的目标。所谓“特效试剂”，就是指的是只与一

种待测物质反应的试剂。事实上，目前使用的所谓的“铜试剂、“铁试剂”、“硝酸试剂”等

等,都是“盛名之下，其实难副”的.20世纪40—50年代追求合成特效试剂的狂热，早已降温.

正在分析化学家心灰意冷之际，人们从免疫学与生物化学的成就看到了这一理想的曙光:免疫系

统简直就是天然存在的一部特异性试剂的合成机器。抗原与抗体之间的免疫反应具有高度的特

异性，这种识别的专一性超过酶对底物的识别水平，抗原-抗体复合物的稳定常数一般为109，

有些高达1010—1015，具有很高的稳定性。免疫反应的特点使得免疫分析已成为一个跨学科的

新型分析技术，广泛应用于临床体液分析、药物分析、环境分析、食品分析和生物化学研究，

尤其在毒品的鉴定、吸毒人员的认定和疾病的诊断方面，发挥了重要作用。

时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是自80年代以来新发展起来的一种新型分析技术，与其

它免疫分析技术相比，有其独特的优点。它克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素带

来的污染问题；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不稳定的缺点；而且,由于TRFIA法能够很好

的消除背景荧光的干扰，使其灵敏度比普通荧光法（FIA）高出几个数量级.正是由于TRFIA的

独特优点，使得它成为免疫分析中最有发展潜力的一种分析方法。

二、时间分辨荧光免疫分析的原理

时间分辨荧光免疫分析的原理就是使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪

物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。

当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物,由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就

含有稀土离子,当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可

测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度,从而确定待测抗原的量。

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正常情况下,免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子

从免疫复合物中解离出来，和增强液中的β-二酮体、三正辛基氧化膦、TritonX—100等成分

形成一种微囊.后者被激发光激发后,则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号,使原来微

弱的荧光信号增强将近100万倍。

采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长

寿命标记物的荧光。

三、时间分辨荧光分析的测量方法

（1）解离增强测量法

解离增强测量法是解离增强稀土离子荧光方法，简称DELFIA法。通过双功能基团把Eu3+或Sm3+

螯合到抗原、抗体或SA上，免疫反应后，部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗

掉。最后用低pH值的增强液，把Eu3+或Sm3+从免疫复合物中解离下来，组成Eu3+—（NTA)3。

（TOPO）3或Sm3+—(NTA)3。(TOPO)3新的螯合物，使荧光强度增强将近百万倍。用Arcus型系

列仪进行液相检测。本法重复性好，特别适用于大、小分子活性物质的检测。采用DELFIA测量，

灵敏度可达10-16—10-18mol的DNA量（即10pgDNA）。此法的不足之处是不能直接测量固相样

品的荧光,需要外加增强液，容易受外源性Eu3+或Sm3+干扰，而影响结果，有待改进。

(2）固相荧光测量法

固相荧光法又称为DSLFIA法.它是通过具有特殊双功能基团的螯合剂BCPDA，把Eu3+或Sm3+与

抗体或抗原螯合.当抗原与抗体发生免疫反应后,固相免疫复合物中Eu3+-BCPDA荧光强度可直接

测量。整个过程不用外加增强液，可以直接测量固相样品的荧光，解决了液相测量带来易于污

染和操作复杂的问题。现已用于核酸探针检测，取得满意进展，国外已制成药盒供应。

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