《mRNA疫苗及药物中dsRNA杂质定量检测-ELISA法》.docx

GB/TXXXXX—XXXX

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ICS65.020.20

CCSB38

团体标准

T/FDSAFORMTEXTXXXXX—FORMTEXTXXXX

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mRNA疫苗及药物中dsRNA杂质定量检测-ELISA法

QuantitativedetectionofdsRNAimpuritiesinmRNAvaccinesanddrugsbyELISAmethod

（征求意见稿）

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX发布

FORMTEXTXXXX-FORMTEXTXX-FORMTEXTXX实施

FORMTEXT中国食品药品企业质量安全促进会??发布

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mRNA疫苗及药物中dsRNA杂质定量检测方法

范围

本文件规范了dsRNA标准品设计、合成、结构修饰和制备技术；dsRNA标准品赋值技术；dsRNA标准品稳定性考察；抗体对筛选，ELISA方法学验证和ELISA检测。

本文件适用于基于ELISA方法定量检测mRNA疫苗和药物中dsRNA杂质的全过程。

规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成对本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T33411-2016酶联免疫分析试剂盒通则

YY/T1183-2010酶联免疫分析试剂盒通则

术语和定义

信使核糖核酸MessengerRNA，mRNA

mRNA是由DNA的一条链作为模板转录而来的单链核糖核酸，携带遗传信息能指导蛋白质合成的一类单链核糖核酸。在细胞内，mRNA通过与核糖体结合，并在tRNA（转运RNA）的帮助下，翻译成多肽链，进而形成蛋白质。mRNA在基因表达过程中起着承上启下的作用，它从DNA传递遗传信息，指导蛋白质的合成，从而控制生物体的生长、发育和功能。

缩略语

dsRNA：双链核糖核酸（double-strandedRNA）

ELISA：酶联免疫吸附试验(enzyme-linkedimmunosorbentassay)

HRP：辣根过氧化物酶（HorseradishPeroxidase）

dsRNA杂质定量检测方法

dsRNA标准品

试剂盒中的标准品应满足以下要求：

应为序列随机的dsRNA。

应包含多种修饰类型，如无修饰、pUTP修饰、N1-Me-pUTP修饰、5-OMe-UTP修饰，以满足不同修饰类型mRNA产品中dsRNA杂质含量的检测。

纯度高，以避免杂质影响dsRNA精确定量。

dsRNA标准品制备及修饰

dsRNA制备的基本思路为：PCR获得转录模板→体外转录→退火形成双链→DNA酶和RNA酶处理→醇沉淀→重悬、定量，dsRNA修饰可通过使用相应修饰碱基完成。

dsRNA标准品赋值技术

对于dsRNA标准品的赋值，在验证纯度的基础上，采用UV法或dPCR法进行绝对定量。对于有修饰的dsRNA，像pUTP、N1-Me-pUTP和5-OMe-UTP修饰dsRNA，因为缺少吸光系数的参考信息，不依赖于吸光系数的dPCR法定量更具有科学性和参考性。

dsRNA标准品稳定性考察

用于ELISA实验的dsRNA标准品应进行稳定性验证，以保证整个试验周期内，标曲测值不会因标准品放置时间有明显改变。

ELISA抗体对的选择

为了保证对不同序列、长度、修饰类型dsRNA的准确定量，ELISA实验中所用的抗体对需进行以下验证：

抗体对应特异性识别dsRNA，对其它类型核酸无识别；

对于同一修饰类型dsRNA，抗体对亲和力基本不受长度和序列影响，抗体对对样本中dsRNA的亲和力与标准品的一致程度决定了定量结果的准确性。

ELISA方法学验证

所建立的ELISA实验方法或采用的商用ELISA试剂盒，应符合GB/T33411-2016和YY/T1183-2010中关于标准品溯源、线性、准确度、灵敏度、精密度等的要求。

ELISA检测流程

仪器设备

酶标仪、微孔板摇床、RNase-free枪头、EP管。

试剂或材料

水

RNase-free水。

洗涤工作液

包含0.05%Tween-20的1XPBS溶液，或其它符合要求的溶液。

样本稀释液

可以通过等体积混合0.1MNaCl和1XTE溶液配制样本稀释液，也可采用其它符合要求的溶液。

dsRNA定量检测

包被

将捕获抗体用包被液稀释至合适浓度，按100μL/孔加至96孔板中，2-8℃过夜孵