核酸分子杂交技术--课件.pptVIP

荧光素标记的核苷酸结构荧光基团通过碳链臂连接到尿嘧啶核苷的5’碳原子上，当被修饰的核苷酸掺入到DNA分子中时，荧光素基团便将DNA分子标记。右图是罗达明的结构。*ppt课件（二）核酸探针的标记方法根据标记物的不同分为放射性同位素标记和非放射性同位素标记。放射性同位素标记中，裂变原子只是简单地掺入探针的天然结构而取代非放射性同系物。在非放射性同位素标记方法中，核酸中正常情况下不存在的化学基团或复合物通过酶学、光化学或合成反应与探针结合。当探针与靶核酸杂交后，探针上的修饰基团可通过适当的指示系统而被检测。*ppt课件根据反应方式不同可将核酸探针的标记方法分为化学法和酶促法两种。化学法是利用标记物分子上的活性基团与核酸分子上的基团（如磷酸基）发生化学反应而将标记物结合到探针分子上的方法，多用于非放射性同位素的标记，如光敏生物素的标记、辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶等的标记。这种方法的优点是简单、快速、标记均匀。酶促法是将标记物（同位素或非同位素）预先标记在核苷酸分子上，然后通过酶促反应将标记核苷酸掺入到探针分子中，或将核苷酸分子上的标记物转移到探针分子上。这种方法是目前实验室最常用的标记方法。*ppt课件核酸探针的酶促标记方法种类较多，如切口平移法、随机引物法、cDNA探针的标记、DNA探针的末端标记、RNA探针以及寡核苷酸探针的标记等，可根据不同的实验需要加以选择。*ppt课件第三节核酸分子杂交相关技术一、传统的核酸分子杂交技术二、原位杂交*ppt课件1.Southern印迹杂交Southern印迹技术是1975年由EdSouthern等首次应用，因而以其姓氏命名，被广泛称为Southernblotting。Southern杂交是分子生物学的经典实验方法。基本原理是将待检测的DNA样品固定在固相载体上（硝酸纤维素膜或尼龙膜），与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号。一、传统核酸分子杂交技术*ppt课件 ↓分离开的DNA片段电转移至尼龙膜上Southern印迹杂交步骤示意图*ppt课件标记探针与膜上DNA片段杂交

→显示与标记探针杂交的DNA片段↓图9－1７-2Southern印迹杂交步骤示意图*ppt课件Southern印迹技术的应用：检测基因组中某一特定基因的大小、拷贝数、酶切图谱和它在染色体中的位置检测基因点突变—利用限制性片段长度多态性*ppt课件2.Northern印迹杂交

对RNA的检测也可以利用与DNA检测相同的印迹技术来分析。相对于Southernblotting，RNA印迹术被趣称为Northernblotting。Northern印迹杂交与Southern印迹杂交的方法类似，只是变性剂不同。Southern印迹技术中使用的使DNA变性的试剂为NaOH。因为NaOH会水解RNA的2-羟基基团，所以Northern印迹技术中使RNA变性的试剂为甲基氧化汞、乙二醛或甲醛。甲基氢氧化汞是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。在Northern印迹中，所有操作均应避免RNase的污染。*ppt课件ppt课件

核酸分子杂交技术

基因工程研究所

*ppt课件第一节核酸分子杂交的基本原理核酸的变性与复性核酸分子杂交的基本原理第二节核酸探针常见的核酸探针核酸探针的标记第三节核酸分子杂交相关技术传统的核酸分子杂交技术原位杂交*ppt课件第一节核酸分子杂交的基本原理一、核酸的变性与复性二、核酸杂交的基本原理*ppt课件一、核酸的变性与复性（一）变性当有酸、碱、热及某些变性剂（如尿素、乙醇、甲酰胺、胍等）等变性因素存在时，DNA分子双链间的氢键断裂，解离成两条无规则的卷曲状单链DNA，此现象称为变性（denaturation）。*ppt课件DNA变性后，由于双螺旋解体，碱基堆积不再存在，藏于螺旋内部的碱基暴露出来，从而使变性后的DNA对260nm紫外光的吸光率比变性前明显增加，这种现象称为增色效应（hyperchromiceffect）。*ppt课件加热使DNA变性是实验室最常用的方法，称为热变性，DNA热变性发生在一个狭窄的温度范围内。通常将DNA变性达到50%时（即增色效应达到一半时）的温度称为解链温度或熔解温度（meltingtemperature），用Tm表示。*ppt课件影响Tm值的因素：①DNA的碱基组成。DNA的G、C含量越高，Tm值越大；A、T含量越多，Tm值越低。这是因为G-C碱基对含有三个氢键，比