分子生物学技术应用—DNA测序技术.pptx

二代测序技术

二代测序技术——发展历程第二代测序使用最为广泛。以Roche公司的454技术，Illumina公司的Solexa，HiSeq技术为代表

二代测序技术01基本介绍02二代测序技术的方法03二代测序技术的应用

基本介绍01

——捕捉新合成的末端标记来确定DNA序列第二代测序技术边合成边测序或变链接边测序。核心思想高通量、自动化。特点

第二代测序技术（大规模平行测序）一代与二代测序技术的区别对模板体外克隆→单独反应模板DNA打断成小片段→文库扩增→测序。第一代测序技术

第二代测序仪技术的优点优点01保证高准确性02降低测序成本03提高测序速度

二代测序技术的方法02

焦磷酸测序：是一种由DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和三磷酸腺苷双磷酸酶催化的新型酶级联化学发光测序技术，通过对DNA合成反应中释放的生物光信号完成实时监测，开创边合成边测序先河。焦磷酸测序

原理每轮测序反应体系——一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)配对测序引物的3′末端焦磷酸(PPi)释放ATP5-磷酰硫酸（APS）ppi形成荧光素氧化荧光素DNA聚合酶掺入的dNTP＝释放的PpiATP硫酸化酶催化荧光素酶催化可见光

CCD感应器——光信号→检测峰每个峰的高度（光信号）与掺入的核苷酸数目呈正比Apyrase反应体系光信号核苷酸ATP原理淬灭降解再生

454/Roche测序系统原理基于焦磷酸测序法，依靠生物发光对DNA序列进行检测。正确荧光标记的引物、核酸探针、电泳错误快速、准确、高灵敏度、高自动化

不匹配IonTorrent/LifeTechnologies测序系统DNA分子DNA分子核苷酸DNA分子PH值变化→结合→释放HH→PH值改变→数字信号＝两个相同的碱基芯片记录两个相同的碱基检测双倍电压检测不到电压不会记录碱基

4.Solexa/Illumina测序系统测序系统同时完成传统基因组学研究和功能基因组学研究。测序仪一次读取1,000个左右碱基，DNA样品制备和分析时间长。测序系统高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本。

二代测序技术的应用03

应用

应用

第二代测序技术的核心思想是什么？思考题

三代测序技术

目录01基本介绍02三代测序技术的方法03应用

发展历程第二代测序使用最为广泛。以Roche公司的454技术，Illumina公司的Solexa，HiSeq技术为代表

基本介绍01

三代测序技术重组DNA分子以不经扩增的单分子测序和长读长为标志的测序技术称为第三代测序，这些技术一次可读取长达数万碱基的片段，大大降低了拼接难度，更重要的是大大减少了过去无法定位的漏洞。

三代测序技术优势①第三代基因测序读长较长，可以减少拼接成本，节省内存和计算时间；②作用原理上避免了PCR扩增引入错误；③拓展应用：RNA的序列，甲基化的DNA序列等；缺陷①单读长的错误率偏高，需重复测序以纠错（增加测序成本）；②依赖DNA聚合酶的活性；③成本较高（二代Illumina的测序成本是每100万个碱基0.05-0.15美元，三代测序成本是每100万个碱基0.33-1.00美元）。④生信分析软件不够丰富、数据积累少。

三代测序技术的方法

02

1.PacificBiosciencesSMRT测序技术发展历程SMRT测序技术由Webb和Craighead提出，Korlach、Turner、PacificBiosciences（PacBio）将其进一步发展，并于2009年作为PacBio测序平台推出。

1.PacificBiosciencesSMRT测序技术原理PacBioSMRT技术其实是应用了边合成边测序的思想（使用4色荧光标记4种碱基），其超长读长的关键在于使用了活性持久且高保真的DNA聚合酶，并以SMRT芯片为测序载体（ZMW原理）。

1.PacificBiosciencesSMRT测序技术优势及劣势①SMRT技术的测序速度很快，每秒约10个dNTP；②错误率较高，达到15%，出错随机，可通过多次测序来进行有效的纠错（如使用Sparc对30X的数据进行分析，错误率可达到0.5%）；③原始DNA不被破坏；④读长可达10kbp。

2.OxfordNanoporeTechnologiesNanopore测序技术发展历程Bayley于2005年成立OxfordNanoporeTechnologies（ONT）公司，2014年第一个消费级别的纳米孔测序仪的原型机——MinION在ONT诞生。

原