DB12∕T 956-2020 奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定 酶底物法.docx

ICS65.020.30B43

DB12

天津市地方标准

DB12/T956—2020

奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法

Determinationoftotalcoliforms,fecalcoliformsandEscherichiaColiindairyfarmmanure-Enzymesubstratemethod

2020-08-18发布2020-10-01实施

天津市市场监督管理委员会发布

DB12/T956—2020

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前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。

本标准起草单位：农业农村部环境保护科研监测所、军事科学院军事医学研究院环境医学与作业医学研究所。

本标准主要起草人：赵润、李辰宇、王景峰、张克强、谌志强、杜连柱、梁雨。

DB12/T956—2020

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奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的测定酶底物法

1范围

本标准规定了基于酶底物法测定规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的技术要求及操作方法。

本标准适用于规模化奶牛场粪污中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的同时测定。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682—2008分析实验室用水规格和试验方法GB/T27522—2011畜禽养殖污水采样技术规范

HJ1001—2018水质总大肠菌群，粪大肠菌群和大肠埃希氏菌测定酶底物法

3术语和定义

HJ1001—2018界定的以及下列术语和定义适用于本文件，为了方便使用，以下重复列出了HJ1001—2018中的某些术语和定义。

3.1

总大肠菌群和粪大肠菌群totalcoliformsandfecalcoliforms

奶牛场粪污中常见的肠杆菌科细菌，恒温（总大肠菌群：37℃;粪大肠菌群：44.5℃)培养后可分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成黄色邻硝基苯酚。

3.2

大肠埃希氏菌EscherichiaColi

俗称大肠杆菌，恒温37℃培养后既能够分解选择性培养基中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成邻硝基苯酚，同时可以分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放4-甲基伞形酮，在365nm紫外光源照射下显蓝色。

[HJ1001—2018，定义3.3]3.3

最大可能数mostprobablenumber（MPN）

一种基于泊松分布的间接计数方法。根据一定体积不同稀释度样品经培养后产生的目标微生物阳性数，查表估算一定体积样品中目标微生物存在数量。

[HJ1001—2018，定义3.4]

4粪污样品采集

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4.1采样物品

采样容器应使用一次性无菌容器，或经121℃、20min高压灭菌处理。其余采样工具、文具、器具、防护用品按照GB/T27522—2011中第4.1款规定执行。

4.2采样方法

按照GB/T27522—2011中第4.4.2款的规定执行。

4.3样品保存

采样后应在低温（4℃)条件下保存并在6h内完成测定。

5酶底物测定

5.1方法原理

在选择性培养基中培养18h～24h，总大肠菌群和粪大肠菌群能够产生β-半乳糖苷酶并分解培养底物中的邻硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷（ONPG）生成邻硝基苯酚（ONP），该物质在白光或日光照射下显黄色。大肠埃希氏菌可以分解4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）释放4-甲基伞形酮，在365nm紫外光源照射下显蓝色。计数97孔板中阳性单元格出现数量，查MPN表，分别计算样品中总大肠菌群、粪大肠菌群和大肠埃希氏菌的浓度值。

5.2试剂材料

5.2.1分析时应使用符合GB/T6682—2008中三级水规定要求的实验用水，并经121℃、20min高压灭菌后使用。

5.2.2培养基宜采用HJ1001—2018中第6.1款规定的MinimalMediumONPG-MUG培养基。每100mL预处理后的样品应使用培养基粉末2.7g±0.5g，培养基可采用市售商品化培养基制品，成分见表1。