京秀葡萄四倍体诱变研究初报-秋水仙素.docx

?

?

京秀葡萄四倍体诱变研究初报

秋水仙素

?

?

论文导读:：近年来，早熟、大粒的四倍体葡萄深受市场的欢迎。但目前，葡萄四倍体品种数量较少，遗传背景狭窄，因此，四倍体葡萄诱导对于育种和生产都具有重要意义。本试验以秋水仙素为诱变剂，采用浸泡单芽茎段法和混合培养法对京秀葡萄进行组培诱导，探索秋水仙素浓度以及不同处理方法对变异的影响，并利用流式细胞分析仪对诱变效果进行分析。结果表明：对于浸泡单芽茎段法，浓度的影响强于处理时间，最佳诱导浓度及时间为0.3%处理24小时；而对于混培法，处理时间的影响却强于浓度，最佳诱导浓度及时间为2000mg/L处理30天。

论文关键词：葡萄，秋水仙素，四倍体诱导，倍性分析

?

多倍体育种可以高效率的改变果树的某些性状，从而提高产量，改良品质，增强抗逆性，因此，多倍体育种倍受果树育种学家青睐[1][2]。近年来，早熟、大粒的四倍体葡萄深受市场的欢迎。但目前，葡萄四倍体品种数量较少，遗传背景狭窄，多为巨峰的后代[3]。因此，四倍体葡萄的诱导对葡萄育种和生产都具有重要意义。葡萄四倍体育成的方法主要有人工诱变、有性杂交和自然选择等方法，其中人工诱变法是葡萄四倍体育种常用的方法[4]。本试验以秋水仙素为诱变剂，对京秀葡萄进行组培诱导，探索秋水仙素不同浓度以及不同处理方法对诱变染色体变异的影响，利用倍性分析仪对诱变多倍体整株进行分析鉴定，以期为葡萄四倍体的诱变寻找简单有效的途径。

1.材料与方法

1.1培养基和培养条件

试验采用MS培养基,添加0.6%的琼脂粉，2.5%蔗糖。PH调至5.5。采用湿热灭菌法，用手提式高压锅灭菌，121℃保持15分钟。激素和秋水仙素在灭菌前加入。培养条件：25士2℃，光照强度为2000Lx，日照时间12h小时的培养室中进行培养。

1.2浸泡单芽茎段法诱导四倍体

将无菌的带单芽茎段浸泡在各浓度（0.05﹪，0.1﹪，0.2﹪，0.3﹪秋水仙素，0.4﹪）的秋水仙素中，包好瓶口，避免强烈光照，分别处理6h,12h,24h，48h，72h。处理过程中轻轻摇动以使诱导材料与药液充分接触，以无菌水为对照，处理后接种到培养基(MS+6-BA(2.5mg/L)+IBA(0.1mg/L))上培养。待腋芽萌发后取部分芽尖进行倍性鉴定，生根诱导(1/2MS+IBA(0.5mg/L))20天后取根尖进行倍性鉴定，研究植株倍性变化中国论文下载中心。培养30天后对组培苗的生长量进行测定。

1.3混培法诱导四倍体

将一定浓度的秋水仙素水溶液加入MS培养基中，配成分别含秋水仙素50mg/L、100mg/L、500mg/L、1000mg/L、2000mg/L经高压灭菌。选取苗龄12-15天左右根系长为1.5cm的健壮组培苗，带根转入尚未完全凝固含秋水仙素的培养基中，每个梯度处理10株，重复三次，分别处理15d、30d、40d后，剪取芽尖进行倍性检测。

1.4倍性检测

使用美国BD公司生产的FACSAria型流式细胞分析系统测定单个细胞核的DNA含量，通过倍性分析仪对植株进行倍性检测。对诱导后的植株进行倍性分析，应以未经处理的京秀二倍体为对照。具体方法如下：取生长良好的组培苗的根尖50mg或茎尖30mg，在滴有1mL提取缓冲液[15mmol/LTris-HCl(pH7.5),80mmol/LKCl,20mmol/LNaCl,20mmol/LEDTA-Na-2,15mmol/L巯基乙醇和0.05%(v/v)TritonX-100]的培养皿中用锋利刀片迅速切碎，260目尼龙网包住移液枪头过滤吸取，再通过400目细胞筛过滤,滤液用标准试管收集，暗处放置3小时，加入0.5mLRnaseA溶液[100mgRnaseA溶于10ml10mMTris-HCl（PH7.5），15mMNACL中，100℃煮沸15min，冰浴冷却，-20℃保存]，置暗处，37℃培养30min，冰浴冷却再加入10μg/mL碘化丙锭0.6mL，随即上机测定。

2.结果与分析

2.1诱导前京秀的葡萄倍性检测

取生长良好的京秀组培苗，取其根尖50mg及茎尖30mg，分别提取并过滤，按1.4的方法进行测定，测定的结果为二倍体，如图1。

?

?

a.茎尖DNA含量分布图b.根尖DNA含量分布图

a.DistributionofDNAcontentinstemtipb.DistributionofDNAcontentinroottip

图1京秀茎尖及根尖DNA含量分布图

Fig.1DistributionofDNAcontentinstemtipandroottipof“jingxiu”

2.2浸泡单芽茎段法诱导四倍体对植株生长情况的影响

在生长过程中，京秀组培苗