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水稻基因组DNA提取,PCR,纯化分子生物学实验报告--第1页
分子生物学实验报告
实验内容:设计一个完整的实验,以水稻基因
组为例,最终得到纯化的一个基因片段。
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水稻基因组DNA提取,PCR,纯化分子生物学实验报告--第1页
水稻基因组DNA提取,PCR,纯化分子生物学实验报告--第2页
水稻基因组DNA提取以及基因片段的扩增、纯化和检测
1.实验目的:
1.1熟练掌握实验室分子生物学相关的仪器的规范使用方法
1.2遵守实验室相关的实验规章制度,服从实验人员的管理
1.3熟练掌握实验室有关植物基因组DNA的简单提取方法以及检测方法
1.4了解琼脂糖凝胶电泳的原理,掌握胶体制备的方法以及电泳仪的操作方
法
1.5掌握PCR技术的操作流程,熟练使用PCR仪并了解其工作原理及检测方
法
1.6了解柱纯化的原理及使用方法
2.实验原理
1)水稻叶片基因组DNA提取
水稻属于真核生物,其DNA以双链线性高分子形式存在于细胞核中,一般
以染色质形式在。由于植物组细胞破裂之后,DNA酶会水解DNA因此在提取过
程总要加入EDTA螯合剂从而抑制DNA酶活性。
水稻叶片基因组DNA的提取主要是通过破碎组织和细胞从而通过对细胞内
其他杂质的去处来达到基因组DNA的提纯。提纯的产物通过1%的琼脂糖凝胶电
泳进行检验。
本实验是通过CTAB法来进行提取的,它是一种阳离子表面活性剂,能溶解
细胞膜和和核膜蛋白,使核蛋白解聚从而使DNA游离出来,已达到分离的目的。
2)特定基因片段的PCR扩增
PCR(PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或
RNA的方法。它包括三个基本步骤:(1)变性(Denature):目的双链DNA片段在95℃
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水稻基因组DNA提取,PCR,纯化分子生物学实验报告--第2页
水稻基因组DNA提取,PCR,纯化分子生物学实验报告--第3页
下解链;(2)退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(55℃左右)下与模板上的
目的序列通过氢键配对;(3)延伸(Extension):在TaqDNA聚合酶合成DNA的最适
温度下,以目的DNA为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每
一轮循环将使目的DNA扩增一倍,这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环
的模板,所以经30轮循环就可使DNA扩增上百倍。
3)PCR产物的纯化
PCR产物的纯化在本实验中是通过柱纯化的方法进行的。试剂盒吸附柱中的
硅胶膜可以再高盐度的缓冲液下结合DNA,在通过低盐度的缓冲液洗脱,通过这
样的纯化过程去除了除特定产物外的其他DNA样品以及各种杂质。
4)DNA的琼脂糖凝胶电泳检测
琼脂糖凝胶电泳是利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应来达到
混合物分离的目的。DNA分子的迁移速率与其相对分子质量成反比,此外不同构
型的DNA分子的迁移速率不同(cccDNAlDNAocDNA)。通过EB染色即可在紫
外灯下观察到胶体中DNA的纯度、大小等情况。
3.实验试剂和实验仪器
1)实验试剂
CTAB提取液、苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)、氯仿/异戊
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