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PCR技术及习题

PCR（polymerasechainreaction）：聚合酶链式反应

1、PCR原理：在解旋酶作用下，打开DNA双链，每条DNA单链作为母链，

以4中游离脱氧核苷酸为原料，合成子链，在引物作用下，DNA聚合酶从引物

3端开始延伸DNA链，即DNA的合成方向是从子链的5端自3端延伸的。实际

上就是在体外模拟细胞内DNA的复制过程。DNA的复制需要引物，其主要原

因是DNA聚合酶只能从3′端延伸DNA链。

2、PCR反应过程是：变性→复性→延伸

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引

物。

PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：

①模板DNA的变性：当温度上升到90℃以上时，双链DNA解聚为单链，以便

它与引物结合，为下轮反应作准备；

②模板DNA与引物的退火（复性）：温度下降到50℃左右，两种引物通过碱基

互补配对与两条单链DNA结合；

③引物的延伸：72℃左右时，TaqDNA聚合酶有最大活性，可使DNA新链由5

端向3端延伸。

3、结果：上述三步反应完成后，一个DNA分子就变成了两个DNA分子，随着

n

重复次数的增多，DNA分子就以2的形式增加。PCR的反应过程都是在PCR

扩增仪中完成的。

4、细胞被DNA复制与PCR技术的比较：

细胞内DNA复制体外DNA扩增（PCR）

解旋在解旋酶作用下边解旋边复制80～100℃高温解旋，双链完全分开

不同酶DNA解旋酶、DNA聚合酶TaqDNA聚合酶

点

引物RNADNA、RNA

温度体内温和条件高温

①需提供DNA模板

相同点②四种脱氧核苷酸为原料

③子链延伸的方向都是从5端到3端

知识点拨：

1、DNA分子复制的人工控制

解开螺旋：在80～100℃时，DNA双螺旋打开，形成两条DNA单链，称为变性。

恢复螺旋：在50～60℃左右时，两条DNA单链重新形成双螺旋结构，称为复性。

复制条件：缓冲液，DNA模板、四种脱氧核苷酸、热稳定DNA聚合酶、两种

引物。

控制仪器：PCR仪（温度周期性自动调节仪）。

2、PCR的含义是多聚酶链式反应。

3、PCR技术反应的条件：①稳定的缓冲溶液环境（之间）；②DNA模板；③合

成引物（2个）；④四种脱氧核甘酸；⑤DNA聚合酶；⑥温控设备

4、PCR技术最突出的优点是快速、高效、灵活、易于操作。

5、TaqDNA聚合酶的特点是：耐高温。

知识拓展：

1、DNA聚合酶不能够从头合成DNA，只能从DNA的3端开始延伸DNA链，

因此DNA复制需要引物。

2、引物:引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模

板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设

计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。

3、PCR引物设计原则：

（1）PCR引物通常长15-25碱基，其中G＋C约占50%。

（2）引物之间不能互配形成双链结构，引物内部也不能形成发夹结构。

（3）引物的3’末端必须与目的片段完全相配。

（4）引物的5’末端可以不与目的片段互补，可以包含内切酶位点或启动子序列，

但在下一轮反应中，这些序列会被同样合成

习题训练

1．聚合酶链式反应(PCR技术)是在实验室中以少量样品DNA制备大量DNA的

生化技术，反应系统中包括微量样品DNA、DNA聚合酶、引物、足量的4种脱

氧核苷酸及ATP等。反应中新合成的DNA又可以作为下一轮反应的模板，故

DNA数以指数方式扩增，其简要过程如右图所示。

微量DNA样品

DNA互补链分离开为单链