关于连接反应的心得.pdf

关于连接反应的心得--第1页

关于连接反应的心得

关于连接反应的心得

关于连接反应的心得

最近我在进行转基因载体构建，其中关键步骤包括酶切、酶切片

段回收、载体与外源基因A的连接、转化以及重组子的鉴定。我的工

作首先是将基因A（5kb）连接到表达载体B（22kb），然后还要将标

记基因（6-8kb）连到带A的载体上，这其中包括粘末端连接、平端

连接、同尾（相同粘性突出端）连接以及双酶切定向连接。但是我在

进行A和B连接时废了1个多月，经高人指点后才连接成功，之后几

步连接也相当顺利，经过无数次失败后终于成功，欣喜之余将一点实

验心得写下来，供大家参考。

1．关于不同连接方式的效率：

根据载体自连的可能性大小，可以总结出不同连接方式的效率高

低，双酶切定向连接粘末端连接=同尾连接平端连接。如果将载体

双酶切后的非目的片段去除干净，定向连接将很难自连，而平端连接

最容易造成载体自连

2．关于载体和insert的酶切处理：

这是连接反应中最关键的问题之一。我做的第一步连接失败的原

因在于insert（基因A）的处理，基因A是从一个中间载体（两个SalI

位点）用SalI酶切下来，之后用Bio101（USA）的GELextraction

kit（Glassmilk回收）回收，然后与经XhoI（与SalI同尾）酶切的载

体连接，重复了十几次，一直很失败，后来才听人说Glassmilk回收

较大片段时容易造成片段降解，同时有可能破坏粘末端，可能国内大

部分胶回收KIT回收2kb以上片段时，都会有这种情况。于是我采用

此人建议在酶切中间载体时，除加SalI外，还选用中间载体上非目的

片段中特有的酶（基因A中千万不能含此酶，选用该酶可以有效防止

载体自连）进行酶切，酶切后不回收只是65C保温15分钟使内切酶变

性即进行连接，结果从22个克隆中筛得3个重组子。尝到甜头后，我

在后面的双酶切定向连接中也采用这种处理方法，即对载体进行双酶

关于连接反应的心得--第1页

关于连接反应的心得--第2页

切时，选用非目的片段中特有的1-2个酶同时进行酶切，insert也是

如此处理，基本上每次连接都取得了好的结果，这种酶切方法最适于

双酶切定向连接。采用这种酶切方法，可以减少切胶回收，。至于酶

切后处理，我对照了65C保温15分钟直接连接与酚仿抽提后乙醇沉淀

两种处理方法，效果无明显差异。而前者省时省力省钱，因此我倾向

采用前者

3．关于载体和insert的摩尔比：这是连接反应中另外一个关键问

题。一般连接反应的载体和insert的摩尔比为1：3-10，增加insert

的量主要是减少载体自连，从而提高载体和insert的连接效率。但是

这个比例并非总是如此，关键看载体和insert哪个更容易自连，如果

载体和insert都经上述酶切方法处理，1：1连接即可；如果载体相对

容易自连，则应增加insert的