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第四章单克隆抗体与基因工程抗体的制备

第一节杂交瘤技术的基本原理

第二节单克隆抗体的制备

第三节基因工程抗体制备

第四节单克隆抗体的应用

将单个B细胞分离出来加以增殖形成一个克隆群落，该B细胞克隆产生出针对单一表位、结构相同、

功能均一的抗体，称为单克隆抗体。

第一节杂交瘤技术的基本原理

杂交瘤技术的原理是使免疫的小鼠脾细胞与具有体外长期繁殖能力的小鼠骨髓瘤细胞融为一体，成为

杂交瘤细胞，最终获得既能产生所需单克隆抗体，又能长期繁殖的杂交瘤细胞系。

将这种杂交瘤细胞扩大培养，接种于小鼠腹腔，在小鼠腹腔积液中即可得到高效价的单克隆抗体。

一、杂交瘤技术

包括两种亲本细胞的选择与制备，细胞融合，杂交瘤细胞的筛选与克隆化。

（一）小鼠骨髓瘤细胞

细胞株稳定，易于传代培养。

细胞株自身不会产生免疫球蛋白或细胞因子。

该细胞是次黄嘌呤磷酸核酸核糖转化酶（HGPRT）的缺陷株。

（二）免疫脾细胞

免疫用抗原尽量提高其纯度和活性，免疫途径多用腹腔内或皮内多点注射法。

如为珍贵微量抗原，可用脾脏内直接注射法进行免疫。

（三）细胞融合

PEG（聚乙二醇）可能导致细胞膜上脂类物质的物理结构重排，使细胞膜容易打开而有助于细胞融合。

（四）杂交瘤细胞的选择性培养

HAT培养液，是在基础细胞培养液内添加次黄嘌呤、甲氨蝶呤和胸腺嘧啶核苷。

1.脾细胞（指B细胞）在一般培养基中不能生长繁殖。

2.骨髓瘤细胞

因缺乏HGPRT而合成DNA，骨髓瘤细胞在HAT培养基中不能增殖而死亡。

3.杂交瘤细胞

由骨髓瘤细胞和脾细胞融合形成的杂交瘤细胞。

由于与脾细胞融合，可获得其HGPRT，可以合成DNA。因此，杂交瘤细胞在选择性培养得以生存而被筛

选出来。

二、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养

单个细胞培养又称克隆化。

细胞克隆化有以下几种方法：

1.有限稀释法；

2.显微操作法；

3.荧光激活细胞分选仪；

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4.软琼脂平板法。

三、阳性杂交瘤细胞的冻存

目前均采用液氮保存细胞。

细胞放入液氮前，需要逐步降温。

复苏细胞时，从液氮罐内取出冻存管，立即浸入37℃水浴。

第二节单克隆抗体的制备

一、单克隆抗体的两大产生方法

（一）动物体内诱生法

先在小鼠腹腔注射液体石蜡或弗氏不完全佐剂，一周后将杂交瘤细胞悬液注射腹腔，1～2周后，无菌

抽取腹水，离心取上清液即可。

（二）体外培养法

将杂交瘤细胞置培养瓶中培养，待培养液颜色改变或细胞过多开始死亡时，收集上清液，离心去掉碎

片及细胞即可。

二、单克隆抗体的纯化

从培养液或腹腔积液获得的单克隆抗体，不需要纯化即可应用于日常诊断或定性研究。

由于其中含有大量来自培养基、宿主或克隆细胞本身的一些无关蛋白，如果用于免疫标记测定，如放

射性核素、酶、荧光素或生物素标记等，必须进一步分离和纯化。

三、单克隆抗体的性质鉴定

（一）Ig类型测定

通常以兔抗小鼠Ig类及亚类抗体与培养液中单克隆抗体按双向琼脂扩散法进行测定，确定其Ig类型

或者Ig亚类型别。

（二）特异性测定

把与相应抗原有关的物质通McAb进行多种免疫学检测，鉴定McAb的特异性。这直接关系到McAb应用

的可靠性。

（三）抗体效价测定

效价以腹腔积液或培养液的稀释度表示，稀释度越高，则抗体效价也越