《分离以尿素为氮源的微生物》教案.docVIP

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实验2分离以尿素为氮源的微生物

【学习目标】

1.使用专一的培养基（含有尿素）分离专一的细菌（有脲酶的细菌）。

2.利用指示剂颜色的变化检知酶（脲酶）所催化的反应。

【教学重点】

对土样的选取和选择培养基的配置

【教学难点】

选择培养基的配置

【教学过程】

（一）引入新课

上节课我们学习了培养基的配置以及接种技术。下面我们来学习如何进行细菌的分离，获得所需要的目的微生物。

（二）进行新课

1.基础知识

1.1尿素是一种重要的氮肥，农作物不能直接吸收利用，而是首先通过土壤中的细菌将尿素分解为氨和CO2，这是因为细菌能合成脲酶。

1.2科学家能从热泉中把耐热细菌筛选出来是因为热泉的高温条件淘汰了绝大多数微生物，这样也适用于实验室中微生物的筛选，原理是人为提供有利于目的菌株生长的条件（包括营养、温度、pH等），同时抑制或阻止其他微生物生长。

点评：生物适应一定环境，环境对生物具有选择作用。所以通过配制选择培养基、控制培养条件等选择目的微生物。

〖思考1〗在该培养基配方中，为微生物的生长提供碳源的是葡萄糖，提供氮源的是尿素，琼脂的作用是凝固剂。

〖思考2〗该培养基对微生物具有选择作用。如果具有，其选择机制是只有能够以尿素作为氮源的微生物才能在该培养基上生长。

1.3在统计菌落数目时，常用来统计样品中活菌数目的方法是稀释涂布平板法。除此之外，显微镜直接计数也是测定微生物数量的常用方法。

【补充】显微镜直接计数是测定微生物的方法。

公式：观察到的红细胞平均数∶观察到的细菌平均数＝红细胞含量∶细菌含量

1.4采用稀释涂布平板法统计菌落数目时，培养基表面生长的一个菌落，来源于样品稀释液中一个活菌。通过统计平板上的菌落数，就能推测出样品中大约含有多少活菌。为了保证结果准确，一般选择菌落数在30～300的平板进行计数。

〖思考3〗从平板上的菌落数推测出每克样品中的菌落数的计算方法是：（平均菌落数÷涂布的稀释液体积）×稀释倍数。

〖思考4〗利用稀释涂布平板法成功统计菌落数目的关键是：恰当的稀释度。

1.5统计的菌落数比活菌的实际数目低。这是因为当两个或多个细胞在一起时，平板上观察到的只是一个菌落。因此，统计结果一般用菌落数来表示。

1.6设置对照的主要目的是排除实验组中非测试因素对实验结果的影响，提高实验结果的可信度。

1.7对照实验是指除了被测试的条件外，其他条件都相同的实验。满足该条件的称为对照组，未满足该条件的称为实验组。

〖思考5〗请设计本实验的对照实验组：

方案1：其他同学用A同学的土样进行实验。

方案2：A同学以不接种的培养基作为空白对照。

2.实验设计

2.1实验设计的内容包括实验方案、材料用具、实施步骤和时间安排等。

2.2根据图示2－7填写以下实验流程：

菌落计数

菌落计数

配制土壤溶液

系列稀释

涂布平板与培养

2.3土壤微生物主要分布在距地表3～8cm的近中性土壤中，约70％～80％为细菌。

2.4分离不同的微生物采用不同的稀释度，其原因是不同微生物在土壤中含量不同，其目的是保证获得菌落数在30～300之间、适于计数的平板。细菌稀释度为10-4、10-5、10-6，放线菌稀释度为10-3、10-4、10-5，真菌稀释度为10-2、10-3、10-4。

2.5培养不同微生物往往需要不同培养温度。细菌一般在30～37℃培养1～2d，放线菌一般在25～28℃培养5～7d，霉菌一般在25～

2.6在菌落计数时，每隔24h统计一次菌落数目。选取菌落数目稳定时的记录作为结果，以防止因为培养时间不足而导致遗漏菌落的数目。

点评：菌种中有些菌体增殖快，有些菌体增值慢，所以培养时间要充足，使得每个菌体都能形成肉眼可观察到的菌落。

2.7菌落的特征包括形状、大小、隆起程度、颜色等方面。

〖思考6〗土壤微生物种类最多、数量最大的原因是什么？土壤中营养物质含量丰富，环境条件适宜等。

2.9实验过程

1）取土样用的小铁铲和盛土样的信封在使用前都要灭菌。

2）应在火焰的旁边称取土壤10g。将称好的土样倒入盛有90mL无菌水的锥形瓶中，塞好棉塞。

3）在稀释土壤溶液的过程中，每一步都要在火焰旁进行。

4）实验时要对培养皿作好标记。注明培养基类型、培养时间、稀释度、培养物等。

5）为了提高效率，在操作时更加有条不紊，应当事先规划时间。

〖思考9〗在研究未知微生物时务必规范操作，以防被致病微生物感染，实验后一定要洗手。

3.结果分析与评价

3.1对分离的菌种作进一步的鉴定，还需要借助生物化学的方法。

3.2在细菌分解尿素的化学反应中，细菌合成的脲酶将尿素分解成了氨。氨会使培养基的碱性增强，pH升高。因此，我们可以通过检测培养基pH变化来判断该化学反应是否发生。

3.3在以尿素为唯一的氮源