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噬菌体展示肽库的筛选方法及其应用

1985年,SmithGP利用基因工程手段将一段外源肽序列展示在丝状噬菌体的表面[1]。

1988年[2]他们又将合成的随机序列的寡核苷酸片段克隆到丝状噬菌体,表达后每个噬菌体粒

子的表面展示一种肽段,所有这些展示不同肽段的噬菌体构成了噬菌体展示肽库。1990年,

他们通过亲合筛选,得到了与特定蛋白结合的结合肽,并由于噬菌体表达的肽与编码基因直接

相关,扩增和分离目的克隆后,很容易得到其DNA序列[3]。这样就建立了噬菌体表面展示的

随机肽库技术,这项技术一经产生就显示其无与伦比的生命力,被广泛用于生命科学的各个领

域,并带来广泛而深远的影响。传统的药物筛选大多数是从自然界的动、植物及微生物中分

离天然的具有特定药理作用的化学物质,然后直接应用或再以此作为药物化学的先导化合物,

再进一步设计、加工、合成,筛选有效的功能药物。此方法具有一定的盲目性,筛选周期长。

而采用分子进化工程技术则会大大加速这一过程。根据所需要的药物特性,选用适当的方法

构建含有大量异质性分子的组合库,用靶分子进行筛选,先筛选药物先导化合物,然后进一步

优化设计,最终确定候选的药物结构。近年来,引入组合策略和模拟进化思想,建立了一种从噬

菌体随机肽库中筛选药物先导化合物的新方法[4],即用库容量极大的随机肽库去快速筛选具

有较高特异性和亲和力的理想目的肽。通过此种方法可以快速筛选生物活性肽、蛋白质、受

体及其他化合物等新型药物或先导化合物。这一方法具有传统的药物筛选无法比拟的优越性,

将药物开发带入了一个崭新的时代。1噬菌体展示系统的建立早在1986年Geysen就认为

含有关键残基的短肽能够模拟蛋白质上的决定族。在多数情况下,几个关键残基与它的结合

分子所形成的非共价键构成了全部结合的主要部分,即蛋白质之间的相互作用或识别是通过

局部残基肽段间的相互作用来实现的。1982年,Dulbecco提出将病原体的免疫原与λ噬菌体

和其他病毒的衣壳蛋白融合,便可产生能够用作疫苗的表面展示外来多肽的病毒颗粒。1985

年,Smith描述了外源肽段在丝状噬菌体fd表面的展示结果。1988年,他们建立了新的表达载

体——可选择抗体的丝状噬菌体fd载体,能将外源短肽表达并伸展到噬菌体表面,用亲和筛

选可选到表达特异肽的噬菌体,通过测定噬菌体序列,就可以知道所表达肽段的氨基酸序列。

这为噬菌体展示肽库的建立提供了技术保障。2噬菌体展示系统的类别噬菌体展示系统因

载体和宿主细胞不同分别有:丝状噬菌体展示系统(包括p、p和噬菌体粒展示系统)、λ噬

菌体展示系统及T4噬菌体展示系统。2.1丝状噬菌体展示系统:丝状噬菌体展示系统是外

源基因与g3p或g8p基因融合,并将它以外壳蛋白表面多肽的形式展示出来。它是最早被用

来展示外源肽或蛋白质的系统,也是目前应用最广、发展最完善的噬菌体展示系统。丝状噬

菌体是单链DNA病毒,其通过与细菌纤毛的相互作用感染宿主细胞,然后将病毒DNA注入细

菌的胞质,利用细菌胞质内的酶转变成复制的双链DNA,并通过滚动复制产生子一代DNA分

子。噬菌体展示技术正是利用丝状噬菌体DNA的结构和复制特点,把丝状噬菌体M13或fd

作为良好的基因工程的载体。因它的DNA复制与装配不受DNA分子的限制,因此可以将外

源DNA插入到其一些非必须区,仅导致噬菌体颗粒的加长,而不影响其感染宿主及装配,这样

即可得到一些插入外源DNA的基因重组体。噬菌体还可把插入的DNA片段以融合蛋白的

形式表达在衣壳蛋白上。2.2λ噬菌体展示系统:是将外源肽或蛋白质与λ噬菌体的主要尾

部蛋白PV或