WB-Western-Blot实验步骤及讲解.pptxVIP

WesternBlot;通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色，通过分析着色的位置、深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。;Native;原理;器材：匀浆器、EP管（10ml、1.5ml、100ul）、弯镊、96孔板、冰盒

酶标仪、低温离心机、电子秤等;蛋白提取步骤;蛋白提取步骤;蛋白提取步骤;7.根据BCA测试盒说明书，计算所需A液和B液的量。以每一个小孔里面加入200ul混合液计算，例如需要用到96孔板中的24个孔，则需配制混合液24×200=4800ul，其中A液：B液=50：1，考虑到加样过程中会有液体损失，适当增加配液总体积，可直接加入4800ulA液，4800/50=96ulB液，吹打混匀。

8.向96孔板里面依次加入200ul的AB混合液，再依次加入各蛋白样本，完毕后敲打孔板侧身使混合液与蛋白样本充分混匀。

9.96孔板置于37℃烤箱孵育30min。;蛋白提取步骤;蛋白提取步骤;蛋白提取步骤;材料：蛋白样本（已变性）

器械：玻璃板（厚板及薄板）、玻璃板架、梳子、枪头、移液枪、PVDF膜、滤纸、口罩、手套;1;1.配制SDS凝胶

（1）将玻璃板对应安装至玻璃架，配制相应浓度的分离胶（按照每块凝胶需5ml混合液的量计算）。

（2）加入TEMED混匀后，立即灌入两块玻璃板之间的空隙，每块凝胶约需分离胶4ml。灌胶完成后立即用无水乙醇封边。

（3）室温静置待胶凝固，倒掉上层封边液体，并用滤纸吸干上层空间。

（4）配制浓缩胶，每块凝胶约需2ml，加入分离胶的上层空间后，立即插入相应尺寸的梳子。

（5）室温静置。

注意：清洗玻璃板！防止起泡产生！注意TEMED毒性，避免吸入和接触！;实验步骤;2、SDS凝胶电泳

（1）配制电泳液及电转液（电转液的甲醇在使用前添加，加入后置于4度冰箱待用）。

（2）将玻璃板安装于电泳槽架子上以后，向内加入少许电转液观察是否有漏液，若无即可放入电泳槽中，若有漏液需重新夹取玻璃板。

（3）轻轻拔出凝胶中的梳子，两侧用力均匀保证加样孔无歪斜。

（4）将电泳槽内外均加入足量电泳液以后，开启电泳仪电源，将电压调为60V，预电泳15min，疏通凝胶分子孔径。

（5）预电泳完成后进行蛋白加样。若有多余孔道需用1×Buffer封边，并设置一??加入预染Marker。

（6）电泳。电压调为80V使蛋白样品在浓缩胶内电泳，然后将电压调为110V使蛋白样品在分离胶内电泳，至所需目的蛋白充分分离后停止（根据Marker所标记位置估计切胶宽度≥1cm）。;实验步骤;实验步骤;3、电转

（1）电泳完成后，切胶，电转。电转时按照海绵（1层）、滤纸（2-3层）、凝胶、PVDF膜、滤纸（2-3层）、海绵（1层）的顺序依次铺平，膜和所切下来的凝胶大小对应。注意：避免膜和胶之间的气泡！

（2）开启电转仪，设置电流为250mA，根据目的蛋白分子量大小确定电转时间,1kd大约转膜1min。;3、电转

由于凝胶太脆难以进行抗体与蛋白的自由结合及检测、显影等操作，故需转膜。目前常用NC膜（硝化纤维膜）、PVDF膜（聚偏二氟乙烯膜）。通过电转移法即将电场加于凝胶——使蛋白移出并附着在薄膜上。除此之外，为了防止过热导致转膜板夹层中形成气泡，故转膜时应该置于冰槽中，且注意将冰块置于黑板所在处。;实验步骤;4、封闭

电转完成后，直接取出PVDF膜，可见预染Marker，放入5%新鲜配制牛奶/BSA封闭1-1.5h（5g牛奶/BSA+100mlPBST,注意保质期问题），封闭条件：37度，摇床，50r/min。;5、一抗孵育

根据目的蛋白选择对应的一抗及合适的稀释比例，用封闭液对抗体进行稀释。一抗孵育条件：4℃冰箱，过夜（＞12h）。;6、洗涤一抗。PBST，摇床（80-90r/min），3次×15min或4次×10min。

7、二抗孵育

选用针对一抗来源的二抗，配制成工作浓度后，均匀滴加于PVDF膜上。二抗孵育条件：37度，摇床（40r/min），1h。;8、洗涤二抗。PBST，摇床（80-90r/min），3次×15min或4次×10min。

9、化学发光法显色

准备一个蜡板用于铺膜；按照1:1的比例配制化学发光液，均匀滴加于蜡板上铺好的的PVDF膜上后，操作电脑进行曝光。

10、曝光完毕后，整理实验器材，及时拷取实验数据进行分析。;实验步骤;免疫印迹（Western?blot,?WB）是分子生物学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的最常用方法之一。

WB必须控制上样量以确保目标蛋白变化具有可比性，通常选择在所有组织中普遍分布的具有相对恒定量的蛋白质作为内参（Loading?control）。;当然WB实验中的内参选择也是至关重要，毕竟它以表达水平不变的蛋白作为对照，能