羟色胺对放线菌素D诱导的肝细胞凋亡及作用机制研究.docxVIP

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羟色胺对放线菌素D诱导的肝细胞凋亡及作用机制研究

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摘要目的：探讨5-羟色胺（5-HT）对放线菌素D(ActD)诱导HL7702肝细胞凋亡的拮抗作用及可能机制。方法：本实验采用HL7702正常人肝细胞株，MTT法检测ActD对肝细胞存活力的影响;Hoechst33342进行凋亡形态学染色;DNA凝胶电泳及流式细胞仪检测细胞凋亡数量;Westernblotting方法检测细胞总Akt及磷酸化Akt蛋白的表达。结果：AcD可以诱导HL7702肝细胞凋亡，其浓度在20-50ng/ml范围内呈现剂量效应关系；PI3K特异性抑制剂wortmannin能够增强ActD诱导的肝细胞凋亡作用；5-羟色胺（5-HT）对ActD诱导的肝细胞凋亡有拮抗作用，在一定剂量范围内呈现剂量效应关系；并且5-HT能够激活PI3K/Akt信号转导途径；进一步用wortmannin阻断PI3K/Akt信号途径后，5-HT的拮抗凋亡作用被抑制。结论：一定剂量的AcD可以诱导肝细胞凋亡;wortmannin能够增强AcD诱导肝细胞凋亡的作用；5-HT对AcD诱导的这种细胞凋亡有明显的拮抗作用，并且5-HT的抗凋亡作用与其激活细胞内PI3K/Akt信号转导通路有关。

关键词:肝细胞；细胞凋亡；信号转导；5-羟色胺；放线菌素D

已有证据表明，5-羟色胺（5hydroxytryptamine，5-HT，又称血清素，serotonin）是强大的肝再生促进因子[1]。5-HT作为神经递质在神经系统中的作用已被人们所熟知。然而，它的作用不仅仅局限于神经系统，也参与血管收缩，炎症反应，血液凝固等多种生理反应，同时也是一种具有广泛生理活性的、具有多种组织活性的有丝分裂原，它不但可以促进血管平滑肌细胞、肾小球球膜细胞和神经元细胞轴突增生，对于多种肿瘤细胞,如结肠癌细胞、人胰腺绒毛膜癌细胞、动物和人乳腺癌细胞等都有较强的促增殖作用[2]。5-羟色胺（5-HT）对于肝细胞、内皮细胞、上皮细胞、心肌细胞等具有多重生理调节作用[3]。尤其是5-HT能有效拮抗肝细胞在受到各种凋亡刺激物，如Fas配体、TNF—a、干扰素、胆汁酸、放射线等所致的细胞凋亡，这使得5-HT在临床应用于治疗各种病毒性感染以及化学毒性物质所导致的肝细胞损伤有很大的潜在价值。

研究表明[4]，5-HT对细胞凋亡的拮抗作用是通过与其受体C-met结合后，受体发生二聚化，从而导致胞内C-met的酪氨酸磷酸化，再启动下游的信号转导而发挥其抗凋亡作用。其中，PI3K/Akt途径被认为是一可能的重要途径。放线菌素D(actino-mycinDActD)作为一种转录抑制剂，是实验研究常用的凋亡诱导剂，在ActD诱导ECV304细胞的凋亡中，其机制与阻断Akt转录，进而抑制Akt磷酸化、降低其活性有关[5]。在ActD诱导的HL7702肝细胞凋亡中，5-HT是否也有拮抗细胞凋亡的作用，并且这种拮抗细胞凋亡的作用是否与PI3K/Akt信号通路密切相关呢，则未见文献报道。本研究通过ActD诱导肝细胞凋亡作用，进一步探讨5-HT对细胞的保护作用，以及PI3K/Akt信号途径在5-HT介导的肝细胞凋亡调控中的作用。

1材料和方法

1.1细胞系

正常人HL7702肝细胞株(购于中科院上海细胞所)，用含10%新生牛血清的RPMI-1640培养液，于37°C、5%CO2、饱和湿度条件下培养。

1.2主要试剂

5-HT购于Cytolab公司，ActD、抑制剂wortman-nin、荧光染料Hoechst33342购于美国Sigma公司。Akt抗体、ser473磷酸化Akt抗体均购于CellSignalingTechnology公司，细胞安全裂解液购于Merck公司。

1.3方法

1.3.1MTT法检测细胞存活力取对数生长期的肝细胞，消化后悬浮在一定量的培养液中，计数后调整细胞浓度，按每孔2X104cells/100μL接种于96孔板，置37℃5%CO2、饱和湿度条件下培养24h。细胞贴壁后，吸出培养液，换成加有不同浓度ActD102025305075ng/ml的培养液处理细胞5h后，每孔用RPMI—1640培养液冲洗3次，37°C、5%CO2继续培养24h然后每孔加入20μL0.5g/L的MTT,温育4h,去培养液及MTT,每孔加入100μlDMSO振荡数分钟，30min内在酶标仪(BioTek)上读取570nm处吸光度值(A570nm)，以A570nm值表示细胞的存活力。

1.3.2Hoechst33342核染色分析核形态取5-HT预处理保护，ActD处理和正常培养细胞，吸去培养液后，用预冷的PBS洗3次，40g/L多聚甲醛在4