基因工程的酶学基础(共137张PPT).pptxVIP

第二章基因工程的酶学基础;;;;;;;;;;回文结构：指的是形似回文的一段DNA序列，其特点有二：

1、以某一对核苷酸为中轴，左右同数目的核苷酸彼此呈碱基互补。

2、这两股DNA链若按同方向阅读（如5/3/），其核苷酸顺序相同

如：

5′···GTATCCGGATAC···3′

3′···CATAGGCCTATG···5′;;;;;;;;;;;;;;回顾;完全回文序列具有两个基本的特点：①_____，②_____。

（能够在中间划一个对称轴，两侧的序列两两对称互补配对；两条互补链的5′3′的序列组成相同，即将一条链旋转180°，则两条链重叠）;;;;切割频率是指限制性内切核酸酶在DNA分子中预测的切点数。

由于DNA是由四种类型的单核苷酸组成，假定DNA的碱基组成是均一的，而限制性内切核酸酶的识别位点是随机分布的，那么对于任何一种限制酶的切割频率，理论上应为1/4n，n表示该限制酶识别的碱基数。如果识别4个碱基的限制酶，其切割频率应为每256个碱基有一个识别序列和切点（44=256），识别5个碱基的限制内切酶为1024（45）个碱基有一个识别序列和切点。;;;;;;;概括起来，诱发星活性的因素有如下几种：

(1)高甘油含量(5％,v／v)；

(2)限制性内切核酸酶用量过高(100U／ugDNA)；

(3)低离子强度(25mmol／L)；

(4)高pH(8．0以上)；

(5)含有有机溶剂，如DMSO(二甲基亚砜)，乙醇等；

(6)有非Mg2+的二价阳离子存在(如Mn2+，Cu2+，C02+，Zn2+等)。;5.酶对消化效率的影响;;;;;;;;;;;;;1.严格地说，限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）是指已被证明是_____的酶。基因工程中把那些具有识别_____的内切核酸酶统称为限制性内切核酸酶。;为什么大数内切酶被称为“限制”酶？;;;;;;;;;;;;;;;3.连接酶的浓度;?;;;;;(5)含有有机溶剂，如DMSO(二甲基亚砜)，乙醇等；

2)、酶制剂含甘油成分，酶过量，会因为甘油量大而影响其识别的专一性，诱发星号活力。

合成补平3’隐蔽末端；

如果只有一种dNTP，则降解到该dNTP的位置。

大多数内切核酸酶是限制性的内切核酸酶，只在特定的位点作用。

二、DNAligase的特点

CCAGG或CCTGG序列在第二个C上C5位置上引入甲基

二、常用的DNA聚合酶的特点

T4DNA聚合酶

II限制性内切酶的特性回文结构

GAATTC

不能配对的内含子区域形成的单链环被S1切掉。;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;;大多数是37oC，少数要求40-65oC。

（理论上它能与各种序列的模板结合）

虽然也能切割单链DNA,但效率仅为双链的1/200.

2、加大平齐末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会

EcoP15:CAGCAG

另一种是５６℃，适合于平末端和突出的３’端脱磷酸．

平末端在Co2+代替Mg2+下也可以。

T4DNA聚合酶

但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。

在甲基化酶的作用下，从给体分子S—腺苷甲硫氨酸，转移给限制酶识别序列的特定碱基

如XmaI和SmaI。;;;如果两个DNA片断是黏性末端,但不互补,怎么连?;;;;;同聚物尾巴(homopolymerictail)：当反应混合物中只有一种dNTP时，就可以形成仅由一种核苷酸组成的3‘尾巴。称这种尾巴为同聚物尾巴。;;;;;;;;细菌碱性磷酸酯酶(BIP)和小牛肠碱性磷酸酯酶(CIP)有什么不同?在基因工程中的用途?;;;;;;;;;;;;;;;;;;