《α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测》教案.docVIP

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实验5α-淀粉酶的固定化及淀粉水解作用的检测

【学习目标】

1.认识固定化酶的概念，了解固定化酶的方法，学习制备固定化α-淀粉酶。

2.了解淀粉酶水解淀粉的过程，能够进行淀粉水解的测定。

【教学重点】

制备固定化α-淀粉酶；进行淀粉水解的测定。

【教学难点】

制备固定化α-淀粉酶

【基础知识】

一、酶和固定化酶

1.酶：酶是生物体内催化各种反应的催化剂。酶作为催化剂与一般的催化剂有共同特点：①用量少而催化效率高；②不改变化学反应的平衡点，酶本身在反应前后也不发生变化；③可降低反应的活化能。酶作为生物催化剂的特性有：①催化效率高；②有高度的专一性；③易失活等。

通常情况下酶都是在水溶液中催化底物反应，因此酶在反应系统中是与底物、产物混在一起的，反应结束后，即使仍有较高活力，也很难再回收利用。另外，在水溶液中起作用的酶也给产物进一步分离纯化带来了一定困难。

2.固定化酶：固定化酶又称固相酶、水不溶性酶，它是将水溶性的酶用物理或化学的方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。?固定化酶与游离酶相比不但稳定性好，而且与底物和产物容易分离，且易于控制，能反复多次使用，便于运输和贮存，有利于自动化生产。因此，固定化酶在工业、医学和生化分析等方面的应用发展较快。

直接使用酶和固定化酶催化的优缺点比较

类型

优点

不足

直接使用酶

催化效率高，低耗能、低污染等。

对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。

使用固定化酶

酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。

一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。

二、固定化酶的制作原理

酶固定化的方法由酶的性质和载体特性所决定，主要包括：吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等。

1.吸附法：有物理吸附法和离子交换法两种。物理吸附法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，对蛋白质有高度吸附能力的有机硅胶、活性碳和石英砂等。离子交换法是利用蛋白质的两性性质，使其带有电荷的基团与离子交换剂形成离子键，而被交换结合至交换剂上。

2.共价偶联法（载体偶联法）：酶蛋白的一些基团，包括羧基末端、氨基末端等，在温和的条件下能与载体共价结合，从而被固定。但结合的部位必须不是酶的活性中心，也不是维持其空间结构的必需基团。这种结合稳定性好，酶不易脱落，可使用较长时间。

3.交联法：是指通过双功能试剂，将酶和酶联结成网状结构的方法，交联法使用的交联剂是戊二醛等水溶性化合物。

4.包埋法：是指将酶包裹在多孔的载体中，如将酶包裹在聚丙烯酰胺凝胶等高分子凝胶中，或包裹在硝酸纤维素等半透性高分子膜中。前者包埋成格子型，后者包埋成微胶囊型。

【实验操作】

实验原理：本实验是用吸附法将a-淀粉酶固定在石英砂上，一定浓度的淀粉溶液经过固定化酶柱后，可使淀粉水解成糊精，用淀粉指示剂溶液测试，流出物呈红色表明水解产物糊精生成。

设备及用品：5ml塑料注射器、50ml烧杯、滴管、自行车用气门心及夹子、注射器架、试管及微量离心管3支。

材料：①α-淀粉酶的固定化:在烧杯中将5mgα-淀粉酶溶于4ml蒸馏水中.由于酶不纯,可能有些不溶物。再加入5g石英砂,不时搅拌,30min后装入1支下端接有气门心并用夹子封住的注射器中(石英砂体积约4ml)。用10倍体积的蒸馏水洗涤此注射器以除去未吸附的游离淀粉酶,流速为1ml/min。

②可溶性淀粉溶液:取50ml可溶性淀粉溶于100ml热水中,搅拌均匀。

③5mmol/LKI-I2溶液：称取0.127g碘和0.83g碘化钾。加蒸馏水100ml完全溶解后装入滴瓶中。

步骤：①将灌注了固定化酶的注射器放在注射器架上,用滴管滴加淀粉溶液,使淀粉溶液以0.3ml/min的流速过柱。在流出5ml后接收0.5ml流出液,加入1～2滴KI-I2溶液,观察颜色.用水稀释1倍后再观察颜色。

②实验后,用10倍柱体积的蒸馏水洗涤此柱,放置在4℃冰箱中,几天后再重复上述实验,看是否有相同的结果。

实验反思：如何证明洗涤固定化酶柱的流出液中没有淀粉酶?

可在试管中加入1ml可溶性淀粉，再加几滴淀粉酶柱流出液，保温几分钟后用碘液检验。如仍显蓝色，则流出液中没有淀粉酶了。

【核心解读】

1.酶与固定化酶一样吗？相对酶而言，固定化酶有什么优点呢？

不完全相同，固定化酶是酶的衍生物。酶是活细胞产生的具有催化作用的一类有机物，它是生物体内各种化学反应的催化剂，而固定化酶是将水溶性的酶用物理或化学方法固定在某种介质上，使之成为不溶于水而又有酶活性的制剂。

固定化酶的优点：

①使酶