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利用不同的方法筛选和鉴定转化子

摘要:

通过使用不同的方法，从大肠杆菌中筛选和鉴定出转入了GFP基因并表达出GFP的

菌株。实验先用蓝白斑筛选得到含有载体的转化子，之后用菌落PCR对其中的重组子进行

进一步鉴定，最终通过对表达的产物的检测确证是否能表达出GFP。实验结果表明挑选出

来的菌株并没有表达出GFP，需要挑选其他菌落继续实验。

关键词:

蓝白斑筛选、菌落PCR、GFP、蛋白质检测

前言

我们采用的是目前应用最广泛、技术最成熟、同时也是最经典的微生物基因重组，作为

载体的质粒，我们需要选择或者构建带有多克隆位点和带有抗性基因的质粒，前者有利于基

因顺利导入到受体细胞，后者方便我们对转化产物进行筛选；对于受体细胞，我们所选择使

用的大肠杆菌，具有遗传背景清楚，结构简单，表达效率高，容易获取等优点，已经建立起

一套完善成熟的表达系统，是目前转基因领域最受欢迎、使用最普遍的系统之一。

GFP自从发现以来，已经获得了广泛充足的应用，是生物领域的重要材料绿。绿色荧

光蛋白本身无毒，且不需要其他辅酶或者反应底物，在紫外或者蓝光激发下就可以自主发光，

而且有较好的稳定性，当其基因与其他蛋白质表达基因相融合时，该蛋白质既能保持原有活

性，发光能力也不受影响，这意味着我们可以将GFP与我们想要了解的蛋白质相接合在一

起，将GFP作为荧光标签，对蛋白质的位置、运动、活性以及相互作用等机理进行追踪和

观察，因为这种特性，绿色荧光蛋白具有其他报告蛋白无法比拟的优点，已经在生物研究中

获得广泛的应用。

我们已经通过一系列的实验操作，获取GFP基因，用PCR技术将其扩增并连接到载体

质粒pMD19-TVector上，用CaCl法将其转入到大肠杆菌中，经过本次实验的筛选和鉴定，

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构成了完整的转基因操作流程，将我们的课堂学习和实际操作结合起来，从而对转基因技术

有一个最直接的认识。尽管在当下中国，转基因技术备受争议，但是每一名生物专业的学生，

都应学习了解国际科学社会在转基因领域上所取得的巨大成就，并看到其广泛的应用前景和

巨大的市场潜力，同时将所学习到的关于转基因知识科普出去，让每一个公民都能科学、正

确地认识转基因，理性、客观地参与到关于转基因的有益讨论中去，推进我国生物科学技术

的发展。

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一、材料、试剂和器具

1.材料

转化菌液：经过转化操作的E.coliDH5α菌株(R-，M-，Amp-或者含pMD19-TVector)

2.试剂

含氨苄青霉素(Amp,100mg/L)的LB固体培养基、LB液体培养基、X-gal（200mg/ml）

储存液、IPTG储存液（20mg/ml）、10×PCRbuffer、rTaq酶、dNTPmixtures（dATP，dTTP，

dGTP，dCTP）、无菌蒸馏水、1.5%琼脂糖凝胶、矿物油、DNAmaker、1×10LoadingBuffer

引物溶液(P1、P2各10μM)

P1:GFP-F:5-TAGTCGACTATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3(Tm=65.5℃)(SalI)

P2:GFP-R:5-GCGTCTAGATTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3(Tm=61.5℃)(XbaI)

3.器具

超净工作台、涂布器