门冬酰胺酶的制备与分析.docxVIP

重组天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定

赵雅嫱黄妤璠龙益如王敏敏白华山

1原理

本实验主要是利用基因工程手段构建L-天冬酰胺酶基因工程菌。L-天冬酰胺酶的生理作用主要体现于其抗癌抗肿瘤活性，特别是对非霍奇金淋巴瘤和ALL的有很强的抑制作用，目前适用于治疗黑色素瘤、非何杰金病淋巴瘤等，也可以用于治疗急性单核细胞性白血病、慢性淋巴细胞性白血病等。

目前，我国虽已投入生产L-天冬酰胺酶，但是较国外生产成本高、菌种产酶活性低，提取纯化工艺落后。针对这些问题，本实验对大肠杆菌重组L-天冬酰胺酶的制备、纯化与鉴定进行了系统性的探究，意图改进重组L-天冬酰胺酶的表达，优化其纯化工艺，分析其鉴定方法与性质。

本实验主要进行了重组克隆载体和表达载体构建、表达与鉴定的摸索；酶蛋白的诱导表达条件分析；酶蛋白分离纯化手段的比较和选择，如蔗糖溶液提取、硫酸铵分级沉淀、CM-Sephadex和DEAE-Sepharose离子交换层析以及亲和层析；重组蛋白酶活力监控与本底蛋白活力测定等等。

2实验材料

实验仪器见表1.1。型号和生产厂家根据实验室现有条件核定。

表1.1实验仪器或装置

仪器名称

型号

生产厂家

超净工作台

PCR扩增仪

恒温培养箱

超低温冰箱

台式离心机

恒温摇床

涡轮振荡器

高压灭菌锅

蛋白电泳仪

核酸电泳仪

凝胶成像仪

紫外分光光度计

高效液相色谱仪

扫描型紫外分光光度计

制冰机

超声清洗机

实验试剂和材料见表1.2。材质或规格以及来源根据实验需求以及实验室现有条件核定。

表1.2试剂和材料

试剂或材料

材质或规格

来源

E.coli野生型菌株

CPU21009

实验室储存

pMD18-T

50ng/μl

宝生物工程有限公司

pET-22b

50ng/μl

宝生物工程有限公司

NdeⅠ

10U/μl

宝生物工程有限公司

XhoⅠ

10U/μl

宝生物工程有限公司

T4DNALigase

350U/μl

宝生物工程有限公司

DNA纯化试剂盒

离心柱型

天根生化科技（北京）有限公司

Ni-NTA树脂纯化试剂盒

离心柱型

天根生化科技（北京）有限公司

541gacgtcaccaaaaccaacaccaccgacgtagcgaccttcaagtctgttaactacggtcct

601ctgggttacattcacaacggtaagattgactaccagcgtaccccggcacgtaagcatacc

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1021atccagcagatcttcaatcagtactaa

根据该基因序列，使用Primer5.0设计引物，并考虑到后续构建克隆载体和表达载体的需求，在引物序列中添加限制性酶切位点和保护序列，获得引物如下：

上游引物P1：GTGCAGCACATATGTTACCCAATATCACCA

下游引物P2：GCGCTCGAGTTAGTACTGATTGAAAGATCTG

上游引物P1中包含一个NdeⅠ酶切位点，下游引物中包含一个XhoⅠ酶切位点。所设计引物交由南京华大基因科技有限公司负责合成。

3.1.2大肠杆菌全基因组DNA的提取

使用大肠杆菌基因组DNA全提取试剂盒提取E.coli全基因组DNA，具体步骤如下：

(1)从实验室斜面保存的E.coli野生型菌株CPU21009上，取接种环，挑单菌落，转移到50mL的液体LB培养基，在温度37℃、180r／min发酵过夜。

(2)取菌液1mL至1.5mL的离心管管中，离心机参数调至12000离心2min，离心3min，弃去上清液。

(3)加入0.2mLGA缓冲液，用