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高级生物化学与分子生物学

综合实验报告

一、实验目的

以特定酶基因在大肠杆菌中的克隆、表达和纯化为主线，进行基因操作、蛋白质表达、

亲和层析纯化等的训练，通过集中训练熟练生物化学和分子生物学实验操作，为独立开展

研究生课题研究奠定实验基础。

二、实验原理

利用基因重组技术，将目的基因与载体质粒DNA在体外进行重组，然后把这种重组

DNA转化到感受态细胞，通过一定的诱导条件，使之在受体细胞内增值表达相应的目标蛋

白。为了得到相应的目标蛋白，需要通过亲和层析等手段纯化目标蛋白。

三、实验内容

一）内容一：重组质粒的分离、鉴定与转化

实验1.重组质粒的分离、纯化及检测

实验2.质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收

实验3.感受态细胞的制备、连接与转化

二）内容二：重组蛋白在大肠杆菌中的表达

实验4.细菌的大量培养及重组蛋白的诱导

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三）内容三：重组蛋白的提取、纯化与鉴定

实验5.细菌的收集、破碎与目标蛋白的纯化

实验6.目标蛋白的SDS鉴定

实验1质粒DNA的分离、纯化及检测

材料、设备及试剂

一、材料

转化的细菌，1.5ml塑料离心管,离心管架。

二、设备

微量取液器(20μl,200μl,1000μl)，台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽灭菌

锅，涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。

三、试剂

1.LB液体培养基(Luria-Bertani)：称取蛋白胨(Tryptone)5g，酵母提取物(Yeastextract)

2.5g，NaCl5g，溶于800ml去离子水中，用NaOH调pH至7.5,加去离子水至总体积500mL，

高压下蒸气灭菌20分钟。

2.LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。

3.氨苄青霉素(Ampicillin,Amp)母液：配成50mg/ml水溶液,-20℃保存备。4.质粒提取

试剂盒。

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操作步骤

1.细菌的培养和收集

将含有质粒的菌种用无菌牙签挑取平板上的单菌落接种到2-5mlLB液体培养基(含50μ

g/mlAmp)中，37℃振荡培养约12小时至对数生长后期。

2.取液体培养物1.2mL于Eppendorf管中，然后6000g/min离心2min，弃上清。

3.质粒的提取，参照质粒提取试剂盒说明。

4．-20℃保存DNA以备电泳检测。

实验2质粒的酶切及琼脂糖凝胶电泳回收

材料、设备及试剂

一、材料

质粒；HindⅢ酶及其酶切缓冲液；琼脂糖(Agarose)

二、设备

水平式电泳装置,电泳仪,台式高速离心机,恒温水浴锅,微量移液枪,微波炉或电炉,紫

外透射仪。

三、试剂

50×TAE电泳缓冲液；6×电泳载样缓冲液。

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操作步骤

一、DNA酶切反应

1.反应体系组成：10XBuffer5μL

HindIII1μL

Plasmid20μL